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Enfermedad de
Gumboro: Herramientas Como una Aproximación Para Establecer
Programas de Control
Sergio Vélez Villegas
MV-
Gerente de Línea Avícola
Fort
Dodge- Animal Health
|
 Salud y manejo sanitario
de las aves de corral
Sainsbury
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INTRODUCCION
La prueba de
Imagen de Bolsa es hoy en día una de las herramientas fundamentales que
permite evaluar la sanidad de las bursas de una parvada en su ciclo de
producción, permitiendo identificar en qué momento se presenta el desafío de
campo y que tan fuerte es éste. Este mismo concepto también puede aplicarse en
el proceso de evaluación de las diferentes vacunas, ya sean intermedias,
intermedias plus o fuertes, pues de igual manera, la Prueba posibilita observar
el nivel de regeneración o la no regeneración del tejido bursal, ya sea con un
esquema vacunal o con desafío de campo.
La prueba de RT/PCR-RFLP
permite detectar la estructura genómica del virus existente en las bursas,
clasificarlo en los diferentes grupos moleculares, y así poder identificar
diferentes virus de campo, virus de alta virulencia, virus vacunales, y en
algunas ocasiones, detectar diferentes virus en una misma muestra. La
secuenciación viral es una prueba más detallada que el PCR, pues se hace la
lectura de las diferentes posiciones de variablidad en la región hipervariable
de la VP2.
La suma de estas
tres pruebas, complementada con factores como la evaluación serológica a
matadero para Gumboro, New Castle y Bronquitis, los resultados zootécnicos de
las diferentes parvadas y el conocimiento de los diferentes planes vacunales,
han permitido un acercamiento más real a la situación de la enfermedad en el
país.
2. MATERIALES Y
METODOS.
2.1 Prueba de
Imagen de Bolsa:
se fijaron 5 ó 6 bursas en una solución de formol bufferado a los 14, 21, 28 y
35 días del pollo de engorde. Una vez estén fijadas las bursas y terminado el
muestreo, se envían al laboratorio referencia de histopatología en Mississippi
donde se hacen los respectivos cortes y luego se hacen llegar a Kansas donde con
el monitor de imagen se realizan las respectivas lecturas.
Para realizar
este muestreo hay que tener en cuenta los siguientes aspectos:
Siempre se
muestrean los pollos de un mismo galpón.
Los pollos
seleccionados deben ser de la media del galpón, ni los más pequeños, ni los más
grandes.
En cada edad se
deben eliminar 5 ó 6 pollos.
Se recomienda
abrir las bursas en el momento de extraerlas del ave, para que el formol fije
mejor.
Siempre se debe
usar formol bufferado. La relación de tejido y formol debe ser de 1:10
Las bursas se
envían inmersas en el formol, debidamente marcadas con el número de aprobación,
la edad, el nombre de la granja y la compañía.
El reporte de
esta prueba se da en un score por bursa y se promedia por edad. Este score es el
porcentaje de linfocitos existente en cada bursa y la interpretación se da de la
siguiente manera:
Score rojo:
menor del 25%: fuerte depleción linfoidea originada ya sea por un fuerte desafío
de campo o por el uso de una cepa vacunal fuerte.
Score negro:
26-35%: moderada depleción linfocitaria originada por aplicación de vacuna,
comienzo temprano de infección o regeneración.
Score azul:
bursa intacta debido a no infección de Gumboro, o infección de no más de dos
días o una significativa regeneración postdesafío
2.2 Prueba de PCR
Con base en un
estudio previo de campo para determinar el nivel de desafío y el momento en que
este sucede y sustentado en la apreciación macroscópica de la bursa y el
análisis de imagen, se define el día para fijar las muestras.
Algunas pautas
para que el muestreo sea éxitoso:
Se debe usar una
solución de Fenol Cloroformo y Alcohol Isoamílico con un ph específico para
fijar la estructura genómica del virus.
La relación de
cantidad de tejido y volumen de fenol debe ser 1:10
La idea es fijar
las bursas en las primeras 48 horas de entrada del virus a éstas.
Se fijan 5 medias
bursas.
Una vez extraída
la bursa del ave, se introduce en la solución de fenol y se realiza un leve
macerado con el objeto para que el fenol penetre mejor el tejido y pueda fijar
mejor la estructura genómica.
La muestra
siempre se debe manejar en una temperatura entre 4° a 7°C hasta que llegue a
Laboratorios Idexx.
Una vez fijada la
muestra, se deja 5 días en la solución de fenol, se elimina éste y se cambia la
muestra a otra solución de fenol por otros 5 días. Finalmente las muestras se
extraen, se secan y se introducen en una bolsa con cierre hermético debidamente
marcadas.
Siempre se
realizan dos muestreos en el ciclo de producción de la parvada, estando la
elección de las edades sujetas al momento del desafío. Fijar dos edades permite
tener más factibilidad de detección del virus, estás generalmente suelen ser los
días 21 y 28.
El método usado
es el de Jackwood, aplicado por Laboratorios Idexx en USA. Se usan dos enzimas
de restricción: BstN1 y Mbo1. La BstN1detecta importantes cambios en la región
hidrofílica más grande (Peak A) y la Mbo1 detecta importantes cambios en la
segunda gran región (Peak B). Ambos peaks son determinantes en las
características antigénicas del virus de Gumboro. Según esta clasificación son 6
grupos moleculares, nuevos virus 424 y nuevos patrones moleculares.
2.3 Secuenciación
Viral:
se aplicó la técnica Jackwood.
2.4 Serología:
los sueros para Gumboro se corrieron con los Kits clásicos de Idexx y Synbiotics;
los sueros para Newcastle y Bronquitis Infecciosa se hicieron en algunas
compañías con el Kit de Idexx y Synbiotics, y en otras con HI.
2.5 Resultados
Zootécnicos:
para la interpretación final de los resultados se tomaron datos como mortalidad
más selección, conversión alimenticia y eficiencia americana.
3. TAMAÑO DE LA
MUESTRA:
3.1 Tabla
No.1
Imagen de
la bolsa
|
Edades Pollo de engorde |
Año |
Tamaño de la muestra |
|
14, 21, 28 y 35 días |
2000 |
32 granjas |
|
14, 21, 28 y 35 días |
2001 |
48 granjas |
|
14, 21, 28 y 35 días |
2002 |
61 granjas |
|
Total |
|
141 granjas |
3.2 Tabla No.2
T/PCR RFLP
Edades Pollo
de engorde
|
Año
|
Tamaño de la
muestra
|
|
21 y 28 días |
2000 |
2 granjas |
|
21 y 28 días |
2001 |
17 granjas |
|
25 y 33 días |
2001 |
2 granjas |
|
23 y 31 días |
2001 |
1 granja |
|
21 y 28 días |
2002 |
15 granjas |
|
22 y 29 días |
2002 |
2 granjas |
|
25 y 33 días |
2002 |
1 granja |
|
19 y 26 días |
2002 |
1 granja |
|
Total |
|
41 granjas |
3.3 Secuenciación
Viral
Se secuenciaron 5
virus identificados por PCR expresando problemas en el campo.
3 virus del grupo
molecular 2
1 virus con banda
350
1 virus con banda
370
3.4 Serologías:
se tomaron entre 10 y 15 sueros por granja a sacrificio. Estas tomas fueron muy
inconsistentes.
4. RESULTADOS.
4.1 Tabla No. 3
Análisis de
Imagen de Bolsa Años 2000 a 2002.
Momento del desafío en el campo.
|
Edad |
Desafío en campo |
Número granjas |
Porcentaje |
|
14 días |
Score < 25% |
21 |
15 |
|
21 días |
Score < 25% |
36 |
26 |
|
28 días |
Score < 25% |
60 |
43 |
|
35 días |
Score < 25% |
23 |
15 |
|
14, 21, 28 y 35 días |
Intacta |
1 |
1 |
|
Total |
|
141 |
100 |
4.2 Tabla No. 4
Análisis de Imagen de Bolsa Años 2000 a 2002.
Promedio del Score Bursa por edad.
|
Edad |
Año 2000
Score Bursa % |
Año 2001
Score Bursa % |
Año 2002
Score Bursa % |
|
14 días |
34 |
34 |
39 |
|
21 días |
35 |
33 |
33 |
|
28 días |
35 |
26 |
27 |
|
35 días |
31 |
26 |
24 |
4.3 Tabla No. 5
RT PCR RFLP
|
Grupo Molecular |
Años 2000-2001 % |
Ssp1 |
|
1 |
0 |
0 |
|
2 |
25 |
1 |
|
3 |
0 |
0 |
|
4 |
4 |
0 |
|
5 |
0 |
0 |
|
6 |
0 |
0 |
|
“Nuevos 424” |
18 |
0 |
|
Nuevos Patrones |
14 |
0 |
|
Multipattern |
3 |
0 |
|
Negativos |
32 |
0 |
|
Interferencia |
2 |
0 |
|
Baja Positividad |
2 |
0 |
|
Total Identificaciones |
52 |
1 |
4.4
Secuenciación Viral
Los tres virus
clasificados inicialmente dentro del grupo molecular 2 que se secuenciaron
fueron casi idénticos a Delawere E, excepto que todos ellos presentaron una
variación en la mayor región antigénica del peak B en la posición 325 y uno de
ellos en la posición 320.
En los virus con
bandas 350 y 370 clasificados como nuevos patrones moleculares, se determinó que
tienen un patrón molecular único. Los dos tienen prolina en la posición 222 de
la mayor región antigénica del peak A, y otras sustituciones en el menor peak en
la posición 254, y en la posición 321 del mayor peak B.
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4.5 . Serologías
Es evidente que
donde hay daño bursal fuerte, la serología de Gumboro muestra el desafío
presentando títulos arriba de 5000 a matadero por Elisa Idexx, y arriba de 8000
por Synbiotics. En algunas ocasiones la seroconversión para New Castle se ve
afectada. Las serologías para Bronquitis y New Castle dependen mucho del desafío
en campo.
5. DISCUSIÓN
DE RESULTADOS
El procesamiento
de imagen de bolsa permite identificar la edad aproximada de la entrada del
virus de campo en una parvada, y qué tan severo puede ser el daño bursal
originado por éste. En la tabla No. 3 se observa como en el 43% de los lotes
evaluados el virus de campo entra a la 4ª. Semana, observándose un score de
bursas por debajo de 25%. En el 26% de los lotes el virus entra a la 3ª semana;
los virus tempranos entran en el 15% de los lotes y los virus tardíos también
entran en el 15% de los lotes. Se puede decir que la edad más crítica en que se
presenta el desafío de campo está entre el día 21 y día 28. Este es un hallazgo
que es confirmado por la evaluación macrocópica de las bursas en las necropsias
de rutina en granja. Como efecto secundario a esta caída de bursa, se
desencadenan problemas respiratorios que afectan los rendimientos zootécnicos de
las diferentes parvadas. Cuando este desafío es antes del día 21, los problemas
comienzan más temprano y el cuadro de inmunodepresión es más persistente en la
vida del lote. El desafío más benévolo con la sanidad del lote es el que se
presenta cerca del día 35, donde en la mayoría de los casos, los problemas
secundarios no tienen mayor impacto sobre la sanidad del pollo.
En la tabla No.
4, es evidente como el promedio del score de la bursa en día 14 se mantiene en
los años 2000 y 2001 y mejora 5 puntos en el año 2002. Esto puede explicarse por
varios factores como: el uso masivo de vacuna al primer día de edad, la calidad
y cantidad de Anticuerpos Maternos circulantes en las diferentes progenies,
calidad de pollito, mejores alistamientos y mejor manejo de pollito en primera
semana para efectos de control del desafío temprano. El promedio del score de
las bursas en 21 días decrece levemente del año 2000 al 2001 y 2002, sin ser una
caída crítica; lo que sí pasa en el día 28 cuando se observa una caída de 9 y 8
puntos en el promedio del score del año 2000 al 2001 y 2002 respectivamente,
datos que ratifican lo notificado en la tabla No. 3. Una situación parecida al
promedio del score de la bursa se registra al día 35, momento en el que cae en 5
y 6 puntos respectivamente de los años 2000 a 2001 y 2002.
Una vez se
identificaron líneas base en algunas granjas problema, se empezaron a fijar
muestras en fenol para hacer la respectiva identificación molecular. Como se
observa en la tabla No. 5, el grupo molecular 2 es el más prevalente en el
campo. Estos virus producen una caída de bursa en 3ª y 4ª semana, y al matadero
son bursas con un fuerte grado de atrofia y por ende, una fuerte depleción
linfoidea. Los virus “Nuevos 424” y nuevos patrones moleculares también deprimen
la bursa y producen atrofia, pero no son tan drásticos como el grupo molecular
2. En Colombia nunca se ha identificado grupo molecular 1, mientras que en
Ecuador si hay tres identificaciones que no están reportadas en la tabla 5,
expresando un comportamiento muy similar a los virus del grupo molecular 2 en el
campo. El hallazgo de grupo molecular 4 es muy bajo, y debe ser vacunal.
Solamente se ha logrado identificar un virus del grupo molecular 2 con Ssp1 (+)
y se presentó en una granja donde hubo una problemática muy fuerte compatible
con Gumboro.
Basados en la
prevalencia y persistencia en campo del grupo molecular 2 y nuevos patrones
moleculares con bandas 350 y 370, se tomó la decisión de hacer secuenciación
viral en cinco de tantas identificaciones. Los tres virus clasificados en el
grupo molecular 2 se determinaron mediante esta prueba como un espectro similar
a Delawere E, cada uno de ellos solamente con una variación en un punto de corte
como está explicado en resultados. Los dos nuevos patrones moleculares con
bandas 350 y 370 tienen una secuencia única y tienen prolina en la posición 222
en el peak A de mayor antigenicidad, y también tienen otros sustitutos en la
posición 254 del menor peak y en la posición 321 del segundo mayor peak.
Siempre se ha
encontrado una relación directa entre daño bursal y serología corrida a la
derecha que muestra el desafío. Tanto las pruebas de Idexx como Synbiotics han
sido consistentes con este hallazgo. Las serologías para New Castle y Bronquitis
marcan acorde con el desafío en el campo. En ocasiones con fuerte desafío de
Gumboro, los índices serológicos para New Castle se ven afectados.
También se ha
logrado identificar cómo el daño bursal más el hallazgo de virus de campo, ya
sean nuevos patrones o grupo molecular 2, afectan los rendimientos zootécnicos
de la parvada, siendo más drásticos los virus del grupo 2. Es una constante los
problemas respiratorios secundarios.
6. CONTROL
Este tipo de
evaluaciones han permitido ajustar planes vacunales en cuanto a calendario,
tipo de cepas y vías de aplicación. En granjas problema donde se ha identificado
grupo molecular 2 , “nuevos virus 424” y nuevos patrones moleculares se han
usado cepas de más invasividad sobre bursa observándose en algunos casos una
buena respuesta, pero en otros solamente lograr que el desafío sea más tarde en
la parvada y con menor impacto sobre la baja de los rendimientos zootécnicos.
El uso de éstas
nuevas cepas han ido acompañadas de otros factores que ayudan al control de la
enfermedad como son una mejor bioseguridad, mayor tiempo de descanso de las
granjas, mejores alistamientos de los galpones , la exigencia de un pollito de
mejor calidad.
7.
CONCLUSIONES
Herramientas de
diagnóstico como son el Análisis de Imagen, RT PCR RFLP, la secuenciación viral,
índices serológicos a sacrificio, permiten conocer aspectos determinantes de la
enfermedad en campo como son: edad del desafío, índice de daño bursal, nivel de
regeneración del tejido linfoídeo, la variabilidad antigénica del virus, los
virus existentes ya sean de campo o vacunales, poder hacer una interpretación
fenotípica y genotípica de los diferentes virus, y finalmente lograr una
orientación más real sobre las alternativas vacunales existentes.
8. REFERENCES
1. Cookson C K;
Using Bursal Imaging Analysis to Establish the Window of Infection and the
Appropriate Timing of Live IBD Vaccination; Partnerships in Poultry, Meeting
Fort Dodge Paris : pp 6-8, July 2001.
2. Cookson C K;
Fort Dodge IBD PCR Survey Results in Europe, 2000-2001, Partnerships in Poultry,
Meeting Fort Dodge Paris: pp 14-16, July 2001.
3. Cookson C K;
Relative Efficacy Studies of IBD Vaccines Against Different Field Virus Types;
Partnerships in Poultry, Meeting Fort Dodge Paris: pp 22-25, July 2001.
4. Jackwood D J;
Diagnosis of Infectious Bursal Disease Viruses using the RT/PCR- RFLP assay:
Advantages, Limitations and Comparison to Other Molecular Assays; Partnerships
in Poultry, Meeting Fort Dodge Paris: pp 1-4, July 2001.
5. Jackwood D
J;Genotypic and Phenotypic Diversity Among Wild-Type IBDV Strains; Partnerships
in Poultry, Meeting Fort Dodge Paris: pp: 9-13, July 2001.
6. Fort Dodge
Animal Health, Inc. Research.
