 015. Avances en el diagnóstico molecular de Salmonella. PCR aplicada a la avicultura y a la microbiología de los alimentos.
Alejandra Velilla1, Dr. Horacio Terzolo2
& Dr. Sergio Feingold3.
Abril 2004
Palabras claves: PCR, Salmonella,
diagnóstico molecular, enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs),
avicultura.
Incidencia, Adquisición y Modos de transmisión de
Salmonella
El Género Salmonella (S), agente
etiológico de la salmonelosis, afecta a aves de corral, vacunos,
porcinos y ovinos, entre otras especies. Estas bacterias, son los más
frecuentes agentes causales de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs).
En el período 1995-1999 fueron el segundo grupo bacteriano más importante
causante de ETA en Latinoamérica y el Caribe. La carne de aves, huevos y
productos derivados son alimentos que, muy frecuentemente, ocasionan
brotes de ETAs.
Estudios epidemiológicos, indican que las
aves constituyen un importante reservorio y son fuente de
contaminación de los alimentos. La infección de poblaciones de aves de
corral fue notificada por primera vez a finales de la década de 1970, y
luego durante la década de 1980 se expandió rápidamente a través del Reino
Unido, Estados Unidos, América del sur y otras áreas. Durante este
período, la proporción de casos de salmonelosis atribuidos a S.
serovar (sv) Enteritidis se incrementó sustancialmente, por ejemplo en
Argentina esta enfermedad aumentó 275 veces.
El Género Salmonella, no es
parte de la flora intestinal normal de las aves, sino que lo adquieren en
el ambiente en que viven de insectos, roedores, aves silvestres y el
hombre, así como por medio del alimento balanceado y por condiciones
predisponentes cuando se crían en forma intensiva. Las salmonelas
colonizan el tracto entérico de las aves y posteriormente su materia
fecal, la cual contamina la cáscara de los huevos durante su pasaje a
través de la cloaca y las salmonelas depositadas en las cáscaras pueden
penetrar en la albúmina o clara a través de los poros, donde permanecen
latentes. Esta penetración se produce por un proceso de succión debido a
la diferencia térmica existente entre el huevo recién puesto y el
ambiente. Este proceso ocurre más frecuentemente en gallinas mayores de 1
año, debido a que los poros de la cáscara son de mayor tamaño. Luego, a
medida que el huevo envejece, el hierro contenido en la yema difunde a la
albúmina y al mismo tiempo esta clara de huevo disminuye su contenido de
lisozima, permitiendo así la multiplicación de las salmonelas que estaban
latentes dentro del contenido del huevo.
La materia fecal también puede
contaminar a las carcasas durante el procesamiento en los peladeros de
aves. Si bien la carne de las aves sanas recientemente sacrificadas es
estéril, el tipo de procesamiento que se lleva a cabo en los peladeros
puede influir y causar su contaminación. Las condiciones del transporte
pueden alterar la flora bacteriana que coloniza el intestino y combinados
con el estrés y el hacinamiento que sufren las aves se puede producir un
aumento de las salmonelas justo antes de su faena. Después de la faena es
muy importante mantener la cadena de frío durante todas las etapas de la
comercialización.
Finalmente las medidas de higiene y normas
sanitarias en la cocina y los consumidores son fundamentales. Debido a
esto, la calidad bacteriológica de la carne de ave depende de distintos
factores, algunos de ellos relacionados al transporte, sacrificio del
animal y a su comercialización, siendo también muy importante considerar
ambos extremos de esta compleja cadena, desde el modo de crianza del ave
hasta las normas de higiene de los cocineros y consumidores.
La carne de pollo y los huevos son una
de las mayores fuentes de toxiinfección alimentaria en el hombre, siendo
Salmonella uno de los principales agentes etiológicos. Datos
estadísticos aportados por distintos países señalan que entre el 50 al 90%
de las carcasas de pollo pueden estar contaminadas con Salmonella.
Sin embargo, es importante destacar que mediante la aplicación de medidas
preventivas en la crianza de las aves y en el procesamiento y manejo
comercial de los productos alimenticios y sus derivados, aunadas a una
educación sanitaria de la población para el manejo correcto de los
alimentos, para su almacenamiento y elaboración, es posible reducir
considerablemente el grado de contaminación con Salmonella. El
conocimiento y la comprensión de las principales fuentes de infección de
este patógeno son importantes para el diseño de las medidas de prevención
y de control de las infecciones. La epidemiología de la transmisión puede
variar para cada serotipo y la importancia de las distintas fuentes de
infección varía para cada uno de ellos. Sin embargo, independientemente
del serotipo de Salmonella implicado las acciones preventivas y de
control deben considerar la importancia de las transmisiones vertical y
horizontal.
Paratifosis, Tifosis y Pullorosis
Perteneciente al Género Salmonella,
S.
enterica sv. Enteritidis es una de las más importantes paratifosis de las
aves por la alta difusión entre los animales y su patogenicidad para el
hombre. La sv. Enteritidis se difunde, principalmente, por transmisión
horizontal entre las aves enfermas y en menor grado por trasmisión
vertical a través del huevo a la progenie. En el primer caso la infección
horizontal se propaga, por excreción fecal, aerosoles y contacto, en los
criaderos, plantas de incubación, granjas y plantas de matanza. En el
segundo caso, la transmisión vertical involucra tanto a reproductores que
contaminan sus progenies de pollitos BB e indirectamente a las plantas de
incubación como también a líneas de ponedoras que pueden producir algunos
huevos infectivos por contaminación de la cáscara en el momento de mayor
excreción fecal de salmonelas. Este es el modo más frecuente de
contaminación de los huevos. Además, y sólo excepcionalmente (1 de cada
1.000 huevos analizados), puede contaminarse en forma directa la yema de
los huevos en gallinas que sufren septicemia y peritonitis. El manejo de
los huevos puede aumentar considerablemente la contaminación cruzada por
la re-utilización de maples contaminados y el empleo de huevos mal
conservados o viejos.
Las aves adultas son siempre portadoras
asintomáticas y pueden transmitir trans-ovo la infección a sus progenies,
siendo los pollitos BB los potenciales manifestantes de síntomas, lesiones
y mortandad en grado variable, según el nivel de inmunidad maternal
heredada de sus padres a través del vitelo. La dispersión sistémica genera
transmisión vertical y la excreción fecal extensiva produce contaminación
ambiental difícil de eliminar. Con referencia a la importancia e
implicancias de Salmonella spp. y especialmente de Salmonella
Enteritidis, grupos de trabajo pertenecientes a la Organización de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la
Organización Mundial de la Salud (OMS) examinaron con detenimiento
documentos técnicos sobre la identificación, caracterización y evaluación
de los peligros de la exposición de Salmonella spp. en pollos de
engorda (parrilleros) y huevos.
http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4392E/Y4392E00.htm
http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4393E/Y4393E00.htm
Asociados a los riesgos para la salud, estos
patógenos tienen un significativo impacto económico sobre la industria del
huevo. La S. sv. Enteritidis suele causar una infección
asintomática en aves adultas y los síntomas de la enfermedad sólo se
manifiestan en aves muy jóvenes. En cambio, S. sv. Gallinarum,
con sus biovariedades gallinarum y pullorum, causan la
Tifosis y Pullorosis respectivamente, las cuales son enfermedades mucho
más graves para las aves, tanto adultas como jóvenes, pero no constituyen
peligro para el ser humano, ya que el hombre no es susceptible a dichos
serovares. Ambas enfermedades han sido erradicadas de los criaderos
industriales de la mayoría de los países desarrollados aunque aún
persisten en países en desarrollo, incluyendo varios de América Latina.
Por este motivo, estas enfermedades si bien no constituyen una zoonosis,
deben ser tenidas en cuenta para su diagnóstico diferencial en la región.
Además, la Paratifosis y la Tifosis pueden presentarse en forma conjunta
en los criaderos de aves, afectando a los mismos individuos en forma
simultánea.
Fagotipos y patogenicidad de Salmonella
Enteritidis en Argentina
En las últimas décadas S. entérica sv
Enteritidis encabeza la lista de patógenos emergentes y re-emergentes,
causantes de ETA en Latinoamérica. En Argentina durante el período
1986-1993 se aislaron 68 cepas de S. sv. Enteritidis de criaderos
de pollos parrilleros, reproductores pesados y gallinas ponedoras, y se
determinó que el 38 % de las muestras correspondía al fagotipo (PT) 34, el
38% al PT4, el 8% al PT 7 y el 16% restante a los PT 1, PT 5-a, PT 9-a y
PT 12. Todas estas cepas presentaron transmisión vertical y horizontal y
alta patogenicidad. De este modo, en Argentina la mayoría de las
infecciones en criaderos de aves fueron causadas por cepas del PT 4 o sus
derivados PT 34 y PT 7. Todas estas cepas tienen muy alta patogenicidad y
la mayoría son originarias de Europa, donde se detectaron y describieron
los primeros brotes de la enfermedad asociadas al PT 4. Además de esta
serovariedad, en segundo lugar deben considerarse cepas patógenas de S.
sv. Typhimurium, que si bien actualmente son menos frecuentes como
causa de Paratifosis en aves, tienen también mucha importancia por su
potencial patogenicidad para el hombre, las aves y los animales.
Salmonella en alimentos
En América Latina y el Caribe, la incidencia
de las infecciones de origen alimentario produce una tasa de mortalidad
por diarrea en menores de 5 años de 0.13 ‰ en Trinidad y Tobago, 0.18 ‰ en
Cuba y 9.83 ‰ en Nicaragua. Debido a la falta de reportes, no se poseen
datos estadísticos de muchos países de Latinoamérica.
En el período 1995-1999, Salmonella fue
el segundo agente causal más importante (35,3%) de brotes de ETA en
América Latina y el Caribe. Durante el período 1993-2002 se han registrado
en Latinoamérica 1256 brotes de salmonelosis, que afectaron a 48334
personas y produjeron 15 muertes. El 29,2 % de los casos fue consecuencia
del consumo de huevos o productos derivados y el 9,4 %, fue debido a la
ingesta de carne de aves. El 9,8 % de los brotes fue causado por
Salmonella sv Enteritidis y en el 85 % de los casos no se pudo
determinar la serovariedad implicada (Fuente: Sistema de Información
Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las Enfermedades
Transmitidas por Alimentos {SIRVETA}). Durante el período 1993-2002
ocurrieron en Argentina 60 brotes de salmonelosis que produjeron 889
enfermos y 4 muertos. El 6,7 % de los brotes fue causado por S. sv
Enteritidis, 1,7 % por S. Typhimurium, el 1,7% por S. arizonae
y en el 90% de los casos no se pudo identificar la serovariedad
correspondiente. Con relación a los alimentos involucrados en dichos
brotes el 25% correspondió a derivados de huevo, mayonesa y carne de aves.
http://www.panalimentos.org/sirveta/e/index.htm
Un alto porcentaje de los casos notificados
no puede ser asociado con algún alimento en particular o el patógeno
responsable no puede ser identificado. Esto ocurre debido a que con
frecuencia los resultados de los análisis bacteriológicos demoran y el
alimento implicado ya no se encuentra disponible para su análisis. Por
ello, la real frecuencia de los aislamientos no siempre se conoce y las
publicaciones disponibles reportan muchos menos casos que los existentes.
Estos datos apuntalan la necesidad de lograr la rápida detección de
Salmonella y otros contaminantes en alimentos. Debido a esto, uno de
los principales objetivos en microbiología alimentaria es la
identificación del agente causal por procedimientos cada vez más rápidos y
seguros. Este hecho exige realizar un control de la calidad
bacteriológica de los alimentos que incluye la investigación de especies,
familias o grupos bacterianos cuya presencia refleja sus condiciones
higiénico-sanitarias. Asimismo, la detección del microorganismo
contaminante, directamente en el alimento, prevendría la ocurrencia de
enfermedad y las consecuencias que ésta acarrea.
Actuales Técnicas de Diagnóstico
La detección e identificación de los patógenos
implicados en las enfermedades transmisibles es un componente fundamental
de la vigilancia epidemiológica. Debido a esto es necesario
estandarizar técnicas de detección para implementar la vigilancia y el
control de dichos microorganismos y prevenir las enfermedades que estos
producen en el ámbito nacional, regional y /o mundial. Los métodos
clásicos de diagnóstico bacteriológico son laboriosos, requieren tiempo y
no todas las cepas aisladas pueden ser identificadas, por lo cual la
información que brindan es limitada y dificulta la toma de decisiones. La
temprana detección de los microorganismos, prevendría la aparición de
muchos brotes y permitiría implementar controles previos a la ocurrencia
de enfermedad.
Hasta el momento, el aislamiento y la
identificación de Salmonella se realiza mediante métodos de
cultivo tradicionales, que consisten en las siguientes etapas:
-
Pre-enriquecimiento en medio
líquido no selectivo;
-
Enriquecimiento en medios
líquidos selectivos;
-
Aislamiento diferencial
sobre medios sólidos selectivos;
-
Confirmación bioquímica de
las colonias sospechosas; y
-
Confirmación serológica de
dichas colonias.
Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37ºC
y deben examinarse a las 24 horas. La utilización de sustratos bioquímicos
es la base para la identificación del Género Salmonella. Según el
método bacteriológico de cada laboratorio las colonias pueden ser
inicialmente seleccionadas por algunas pruebas bioquímicas antes de
proceder a su biotipificación completa. La confirmación de estas colonias
requiere tiempo y la mayoría de ellas no son Salmonella, sino otros
géneros relacionados, tales como Proteus o Citrobacter.
http://www.who.int/emc/diseases/zoo/SALM-SURV/pdfs/Level%201_Protocol.pdf
Asimismo, el Servicio Nacional de Sanidad y
Calidad Agroalimentaria (SENASA) reconoce la importancia y la necesidad de
la existencia de métodos de diagnóstico precisos que caractericen
los aislamientos de Salmonella hasta el nivel de serovariedad.
http://www.senasa.gov.ar/sanidad/aves/salmoavi.php
Las aves infectadas con S. gallinarum y
S.
pullorum pueden ser detectadas en las granjas con un método serológico
rápido utilizando sangre total y un antígeno coloreado en una prueba
rápida de aglutinación en placa, aunque las infecciones identificadas
mediante este método deben ser confirmadas mediante una técnica
bacteriológica clásica. También existen métodos de aglutinación, tales
como las técnicas de ELISA, principalmente usada para detectar a
S. Enteritidis. La ventaja de los exámenes serológicos es que se
detecta la persistencia de los anticuerpos IgG circulantes, aunque el
principal inconveniente es que las concentraciones séricas de IgG pueden
ser bajas al principio de la infección y por ende indetectables, mientras
que la excreción fecal es elevada. Otra ventaja de la prueba de ELISA
consiste en su facilidad de aplicación para la detección en gran escala de
aves infectadas. Este enfoque ha sido reconocido por la Unión Europea y la
Organización Mundial de la Salud (OMS) para S. Typhimurium y S.
Enteritidis. También es factible, que dicha técnica reemplace a la prueba
rápida de aglutinación en placa para S. gallinarum y S. pullorum.
Nuevo Método
de Detección Molecular desarrollado por el INTA de Balcarce
Debido al incremento de la prevalencia de S.
sv Enteritidis y su complejo ciclo de vida, la existencia de métodos de
detección rápidos y efectivos son importantes como base de las estrategias de
control. La
técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
del inglés Polymerase Chain Reaction) ha revolucionado el diagnóstico molecular
de las enfermedades infecciosas. A diferencia de los métodos tradicionales, que
requieren 6 o 7 días para dar un resultado definitivo, por el método de PCR esto
mismo se logra en sólo 1 a 3 días, dependiendo de diversas modificaciones en el
protocolo de trabajo.
La técnica de PCR, es un método rápido que
posee ventajas inherentes que la caracterizan y por ende es un excelente método
aplicable a la detección e identificación de Salmonella y de otros
patógenos. Además, las cepas carentes de antígenos somáticos (O) y/o flagelares
(H) (cepas rugosas), que sólo son reconocidas como Salmonella spp. por el
método tradicional de serotipificación pueden ser identificadas mediante PCR,
debido a que esta técnica detecta secuencias específicas de DNA y no es alterada
por variaciones fenotípicas, que se pueden evidenciar por patrones bioquímicos.
Nueva
Propuesta para el diagnóstico rápido de la Tifosis, Pullorosis y Paratifosis de
las aves
Considerando la importancia del tema y la necesidad
de lograr una detección rápida de las aves infectadas, el Laboratorio de
Bacteriología del Área de producción Animal y el Laboratorio de Biotecnología
Agrícola, edificio PROPAPA, trabajaron en forma mancomunada. Ambos
laboratorios pertenecen a la Estación Experimental del INTA de Balcarce y
los objetivos planteados en dicho proyecto conjunto fueron los siguientes:
-
Estandarizar la técnica de PCR
para su aplicación en la detección del Género Salmonella, de cepas
virulentas (portadoras del plásmido spv, que les confiere la
virulencia) y en la subtipificación molecular del sv. Enteritidis; y
-
Implementar un servicio de
diagnóstico expeditivo y práctico para el envío de muestras a distancia
sin la utilización de soportes de vidrio o medios líquidos.
Para cumplimentar estos objetivos se utilizaron 70
cepas representativas de 25 serovares de Salmonella y de otros 20 Géneros
bacterianos y “primers” específicos del Género Salmonella, del
serovar Enteritidis y del citado plásmido de virulencia distintivo de algunos
serovares de Salmonella patógenos, entre los que se encuentran,
Gallinarum, Enteritidis, Dublin, Typhimurium y Choleraesuis. De este modo, se
podría predecir la aparición de brotes, puesto que varios estudios evidencian
que este plásmido es responsable de la virulencia de las salmonelas en las
enfermedades humanas y se ha comprobado que el mismo es esencial para que la
bacteria produzca enfermedad sistémica en animales oralmente inoculados.
En la técnica de PCR que aquí se menciona, se
incluye el mencionado “primer” específico de virulencia que identifica
cepas de Salmonella potencialmente patógenas por ser portadoras del
plásmido spv, un segundo “primer” que detecta específicamente a S.
Enteritidis y un tercer “primer” que detecta específicamente y en general
a cepas de Salmonella spp.
Además está implementado el sistema de diagnóstico
por
PCR para Salmonella mediante la utilización de papeles absorbentes
especiales para el envío de muestras a distancia por correo postal. Una
característica innovadora y práctica del servicio que brindamos, consiste en que
las muestras (hisopados de materia fecal, macerados de órganos, etc.) son
embebidas en papeles absorbentes que actúan como matrices de soporte. De
este modo se evita la utilización de medios de cultivo en tubos o frascos,
reemplazando dichos materiales por el simple despacho de un sobre conteniendo
los papeles con las muestras a analizar. Todo el material necesario para la
recolección de las muestras es provisto por nuestro laboratorio y el envío de
los sobres se realiza por correo postal a la EEA de Balcarce.
Aplicaciones
en la avicultura, la comercialización de sus productos y en la microbiología de
los alimentos
Una aplicación importante de esta técnica es la
rápida verificación y contralor de la salmonelosis en huevos y pollitos BB que
se comercializan entre distintos países, dado que son materiales que requieren
un diagnóstico rápido y preciso en las aduanas. Debido a la expansión del
comercio internacional es necesario fortalecer las medidas de control sanitario
para de este modo evitar la diseminación de numerosos agentes infecciosos entre
distintas regiones. Dentro del área de la microbiología de los alimentos, la
técnica de PCR puede hacerse extensible a cualquier matriz de alimentos que se
desee analizar, tales como muestras de leche y carne vacuna entre otras.
La importancia y la utilidad de las técnicas
moleculares está evidenciada por el interés de crear en Latinoamérica una Red de
sub-tipificación molecular para la vigilancia de los patógenos transmitidos por
alimentos.
http://www.panalimentos.org/panalimentos/art1.asp?id=2960931659&cat=6
Asimismo, en Europa ha sido creada Enter-net,
red internacional para la vigilancia de Infecciones gastrointestinales en el
hombre. Esta red monitoriza fundamentalmente Salmonella y Escherichia
coli O157 y uno de sus principales objetivos es establecer una base de datos
internacional de casos de Salmonella con actualización periódica.
http://www.eurosurveillance.org/em/v04n05/0405-322.asp
Otra importante Red Europea es Salm-Net, cuyo
objetivo es prevenir las salmonelosis humanas en la Unión Europea mediante el
refuerzo de la vigilancia internacional con la creación de laboratorios y de una
base de datos disponible a todos los participantes. Salm-Net está financiada por
el programa BIOMED 1 de la DG XII de la Comisión Europea y es precursora de
Enter-Net. La red está compuesta por microbiólogos y epidemiólogos responsables
de la vigilancia nacional de la salmonelosis en 14 países europeos. Además Salm-Net
tiende a armonizar los métodos de tipificación de fagos de Salmonella
Enteriditis, S. Typhimurium y S. Virchow
http://www.eurosurveillance.org/em/v00n00/0000-325.asp
Una interesante e importante pregunta a responder es
¿Qué acciones son necesarias y deberían ser implementadas para combatir los
desafíos constantes que presentan las salmonelas?, varios expertos del tema
han reconocido al respecto que es preciso garantizar una especialización
epidemiológica suficiente que permita aprovechar los avances en microbiología
molecular y estar siempre al día en este campo que evoluciona a una gran
velocidad.
http://www.eurosurveillance.org/em/v08n02/0802-321.asp.
De este modo dichos especialistas enfatizan la
utilidad y la necesidad de la aplicación de técnicas moleculares tales como la
técnica de
PCR.
Sólo de esta forma podrá asegurarse el control que
requiere la industria alimenticia para conocer la calidad bacteriológica de la
materia prima que utiliza en la elaboración de sus productos, así como en las
etapas intermedias hasta la obtención del producto terminado. Sólo así, se podrá
proporcionar a los consumidores seguridad higiénico-sanitaria.
Esta metodología permite la detección e
identificación rápida y precisa de Salmonella, y se encuentra a
disposición de todos aquellos que estén interesados en utilizar este nuevo
servicio de diagnóstico rápido que ha desarrollado el INTA.
Para obtener
más información contactarse con:
Alejandra
Velilla -
avelilla@balcarce.inta.gov.ar
Dr. Horacio
Terzolo -
hterzolo@balcarce.inta.gov.ar
Dr. Sergio
Feingold -
sfeingold@balcarce.inta.gov.ar
INTA EEA
Balcarce
Laboratorio de
Bacteriología -
Grupo de Sanidad
Animal
Laboratorio de
Biotecnología Agrícola -
Grupo PROPAPA
RN 226, Km
73,3- (CC276).
B7620
EMA-Balcarce-Bs. As.
Tel: (0226)
43-9121/401
Fax: (0226)
43-9101
1Lab.
de Bacteriología-Lab. de Biotecnología INTA EEA Balcarce.
2Lab.
de Bacteriología INTA EEA Balcarce.
3Lab.
de Biotecnología Agrícola INTA EEA Balcarce
Fuente: INTA Balcarce
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