Veterinaria Uruguay [VET-UY] El portal Agro Veterinario - Rumiantes - Bovinos - 111. Susceptibilidad en estafilococos coagulasa positivos.

L.F. CALVINHO1,2* , F.G. TOSELLI2, W.R. WEIMANN2, V.R. CANAVESIO1, V.E. NEDER1, I.A. IGUZQUIZA1

1Estación Experimental Agropecuaria Rafaela, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, C.C. 22 (2300) Rafaela, Pcia. de Santa Fe, Argentina

2Departamento de Patología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral, Rvdo. P. Kreder 2805, (3080), Esperanza, Pcia. de Santa Fe, Argentina

Se determinó la actividad de antimicrobianos utilizados frecuentemente en la terapéutica de mastitis bovina frente a 101 cepas de estafilococos coagulasa positivos aislados de secreción láctea. Los aislamientos provinieron de 39 establecimientos ubicados en la cuenca central de la Argentina. Fue utilizado el método de difusión en agar, evaluándose los siguientes antimicrobianos: penicilina, ampicilina, oxacilina, cefacetril, penicilina+novobiocina, eritromicina, pirlimicina, novobiocina y neomicina. Se encontraron los mayores porcentajes de resistencia frente a penicilina y ampicilina (47,6%), mientras que los menores porcentajes fueron observados frente a eritromicina (2%), pirlimicina (4%) y neomicina (2,9%). No se observaron cepas resistentes frente a oxacilina, cefacetril y penicilina+novobiocina.

Palabras claves: Staphylococcus coagulasa-positivos, susceptibilidad antimicrobiana, mastitis bovina

Antimicrobial susceptibility of coagulase-positive staphylococci isolated from bovine mastitis in the central dairy area of Argentina. The activity of antimicrobial agents frequently used for treating bovine mastitis was determined against 101 coagulase-positive staphylococci isolated from bovine mammary secretion. The isolates were obtained from 39 dairy farms located in the central dairy area of Argentina. The disk diffusion method was used and the following antimicrobial agents were tested: penicillin, ampicillin, oxacillin, cephacetrile, penicilllin+novobiocin, erythromycin, pirlimycin, novobiocin and neomycin. The highest levels of resistance were observed against penicillin and ampicillin (47.6%), while the lowest against erythromycin (2%), pirlimycin (4%) and neomycin (2.9%). No resistant strains against oxacillin, cephacetrile and penicillin+novobiocin were detected.

Key words: Coagulase-positive staphylococci, antimicrobial susceptibility, bovine mastitis

La terapia antimicrobiana es una de las bases de los programas de control de masitis bovina (24). Los casos clínicos de mastitis son usualmente tratados antes de contar con resultados de laboratorio acerca del organismo actuante y su susceptibilidad a los antimicrobianos. Sin embargo, la información obtenida a partir de las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos es de utilidad para seleccionar, junto con parámetros clínicos, las drogas a emplear en un esquema terapéutico dentro de un establecimiento (24). Asimismo, el conocimiento de los patrones de susceptibilidad permite detectar cambios en la resistencia de poblaciones bacterianas en determinadas áreas geográficas (7, 21).

El método estándar de difusión en agar es utilizado como procedimiento de rutina por la mayoría de los laboratorios de diagnóstico veterinario ya que ofrece alta reproducibilidad y cuenta con controles de calidad establecidos (20). Si bien los criterios de interpretación de varios antimicrobianos han sido calculados en base a concentraciones plasmáticas de droga obtenidas en seres humanos, recientemente se han desarrollado criterios de interpretación para nuevos agentes antimicrobianos (18, 19) de uso en terapéutica de mastitis bovina que permiten un manejo más racional de estas pruebas. El objetivo de este estudio fue determinar la susceptibilidad de estafilococos coagulasa positivos aislados de mastitis bovina frente a antibióticos seleccionados usados actualmente en terapia de mastitis.

Se evaluaron 101 estafilococos coagulasa positivos aislados a partir de muestras de secreción láctea de vacas. Las muestras provinieron de 39 establecimientos lecheros de la cuenca central de la República Argentina remitidas al laboratorio de la Estación Experimental Agropecuaria Rafaela del INTA. Los organismos fueron aislados e identificados utilizando métodos bioquímicos convencionales (11). Se sembraron 0,01 ml de secreción láctea en agar sangre ovino al 5%, incubándose por 24 a 48 hs a 35°C. Los aislamientos fueron diferenciados del género Streptococcus sobre la base de morfología colonial, tipo de hemólisis, y prueba de catalasa y del género Micrococcus sobre la base de la prueba de oxidación/fermentación de la glucosa (6). Las cepas caracterizadas como pertenecientes al género Staphylococcus fueron sometidas a la prueba de coagulasa en tubo con plasma de conejo (11). Como control para la prueba de coagulasa se utilizó la cepa S. aureus ATCC 29740 F.H.S. Newbould 305.

Se utilizó el método de difusión en agar, de acuerdo con metodología estándar (2). Se utilizaron los siguientes discos de antimicrobianos: cefacetril (30 ?g) (BBL), penicilina (10 U) (Britania), penicilina+novobiocina (10 U-30 ?g) (BBL), novobiocina (30 ?g) (Britania), eritromicina (15 ?g) (Britania), oxacilina (1 ?g) (Britania), neomicina (30 ?g) (Britania) y pirlimicina (2 ?g) (BBL). Los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento alrededor de los discos fueron interpretados de acuerdo con los criterios desarrollados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (12), mientras que para pirlimicina y penicilina+novobiocina se utilizaron los criterios sugeridos por Thornsberry et al. (18, 19). Como control se utilizó S. aureus ATCC 25923.

Los microorganismos estudiados fueron caracterizados como estafilococos coagulasa positivos ya que no se realizaron pruebas ulteriores para diferenciar entre las distintas especies productoras de coagulasa. Trabajos previos coinciden en que la mayoría de los estafilococos coagulasa positivos aislados de mastitis bovina son S. aureus (5, 15).

Tabla Nº 1. Susceptibilidad a antimicrobianos de cepas de estafilococos coagulasa positivos (n=101) aislados de mastitis bovina en la cuenca central de la Argentina.

Antimicrobiano	Sensible Nº %	Intermedio Nº %	Resistente Nº %
Penicilina	53 52,4	- -	48 47,6
Ampicilina	53 52,4	- -	48 47,6
Oxacilina	101 100	- -	- -
Cefacetril	83 82,2	18 17,8	- -
Eritromicina	39 38,6	60 59,4	2 2
P+N(1)	100 99	1 1	- -
Novobiocina	40 39,6	52 51,5	9 8,9
Pirlimicina	97 96	- -	4 4
Neomicina	73 72,3	25 24,8	3 2,9

Los resultados de las pruebas de susceptibilidad pueden observarse en la Tabla 1. Los antibióticos beta lactámicos se utilizan frecuentemente para el tratamiento de mastitis bovina en nuestro país. Dentro de este grupo de antimicrobianos, la penicilina es el representante más antiguo. En este estudio se encontró que un 47,6% de las cepas fueron resistentes a la penicilina, lo cual fue semejante a lo hallado en estudios realizados sobre cepas provenientes de otras cuencas lecheras (8, 14). En cambio experiencias previas realizadas en la cuenca central mostraron hallazgos dispares (4, 17, 22). Estudios realizados tanto en la Argentina como en otros países indican que un alto porcentaje de las cepas resistentes a la penicilina, son productoras de beta lactamasas o penicilinasas (8, 21), que es considerado el mecanismo más frecuente de resistencia a la penicilina (13).

La ampicilina, un derivado de la penicilina de espectro ampliado, es generalmente incluido en formulaciones para mastitis bovina junto a cloxacilina (24). La susceptibilidad de las cepas frente a ampicilina fue semejante a la observada para la penicilina. La resistencia a penicilina puede extrapolarse a la ampicilina ya que ambos antimicrobianos son inactivados por las beta lactamasas. El porcentaje de cepas resistentes a la ampicilina fue semejante al hallado en estudios previos realizados en nuestro país tanto en la misma (3) como en un área geográfica distinta (1), aunque mayor a lo informado para S. aureus provenientes de mastitis clínicas de la cuenca de abasto de Buenos Aires (14).

La cloxacilina es un antibiótico frecuentemente utilizado en varios países, incluido la Argentina, para el tratamiento de mastitis bovina. De acuerdo con las recomendaciones del NCCLS, en este estudio fue evaluada la oxacilina, un análogo de la cloxacilina, debido a su mayor confiabilidad para detectar cepas de S. aureus meticilino-resistentes (12). En el presente estudio no se encontraron cepas resistentes a la oxacilina, lo cual coincide con lo observado en estudios realizados en el país (1, 8, 14), aunque discrepa con resultados previos obtenidos en la cuenca central (17, 22).

El cefacetril es una cefalosporina de tercera generación, que posee actividad buena a moderada frente a gérmenes Gram positivos y actividad ampliada frente a Gram negativos. La estabilidad del cefacetril contra beta lactamasa estafilocócica es comparable a la de la meticilina y se ha mostrado igualmente efectiva contra cepas de S. aureus penicilino-resistentes y sensibles (23). Un 82,2% y un 17,8% de las cepas fueron sensibles e intermedias al cefacetril, respectivamente, mientras que no se detectaron cepas resistentes. De acuerdo con las recomendaciones actuales del NCCLS las cepas meticilino-resistentes de S. aureus deben ser informadas como resistentes a varias cefalosporinas independientemente del halo de inhibición detectado, ya que las infecciones por estas cepas no responden favorablemente a los antibióticos beta lactámicos (12). Existen escasos datos en nuestro país acerca de la susceptibilidad in vitro de cepas de S aureus frente a este antimicrobiano. En estudios realizados sobre 40 cepas provenientes de siete establecimientos de la cuenca central, se encontró una sensibilidad de S. aureus a este antimicrobiano del 100% (10). Además, estudios recientes realizados en nuestro país muestran escasa o nula resistencia a cefalosporinas de primera generación (1, 8).

La combinación de penicilina y novobiocina (P+N) se ha utilizado desde hace años para el tratamiento de mastitis bovina, considerándose que posee mayor actividad que ambos agentes en forma individual (9). Sin embargo, solo recientemente se desarrolló un disco para la prueba de difusión en agar conteniendo ambas drogas, así como los criterios de interpretación para su uso (19). En esta experiencia no se detectaron cepas resistentes a la combinación P+N, mientras que 47,6 y 8,9% de las cepas fueron resistentes a la penicilina y novobiocina, respectivamente. La media de los diámetros observados para penicilina, novobiocina y P+N fue de 25,55 mm, 20,52 mm y 29,81 mm, respectivamente. Estos resultados indican una tendencia a obtener mayores diámetros de inhibición con la combinación de drogas respecto de los antimicrobianos considerados individualmente a la misma concentración, lo cual concuerda con lo observado por Thornsberry et al (19).

La pirlimicina es un análogo de la clindamicina que posee potente actividad frente a cocos Gram positivos. En esta experiencia la pirlimicina fue utilizada como representante del grupo de las lincosamidas. Para este antimicrobiano, se desarrollaron criterios de interpretación de la prueba de difusión en agar basados en la concentración de pirlimicina obtenida en leche luego de la administración intramamaria de dos dosis de 50 mg. Este parámetro permitió fijar el punto de corte de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del antimicrobiano a partir del cual un organismo es considerado susceptible o resistente (18). En este estudio, 96% de las cepas evaluadas fueron sensibles a la pirlimicina, lo cual concuerda con lo informado recientemente para cepas de S. aureus aisladas de distintas cuencas lecheras (8).

La eritromicina, la espiramicina y en menor medida la tilosina, se utilizan para el tratamiento de mastitis bovina debido a que alcanzan concentraciones efectivas en leche contra S. aureus por lo menos por 12 hs luego de su administración parenteral (24). Los macrólidos y lincosamidas actúan inhibiendo la síntesis proteica al unirse a la unidad ribosomal 50S en la célula bacteriana (13). En este estudio fueron detectadas dos cepas resistentes a la eritromicina, que también mostraron resistencia a la pirlimicina. El porcentaje de cepas resistentes a la eritromicina fue semejante al hallado en un estudio previo en la cuenca central (17), mientras que difiere de lo informado por otros autores en otras cuencas lecheras (1, 14).

La neomicina, perteneciente al grupo de los aminoglucósidos, se ha utilizado como un ingrediente en combinaciones de drogas para el tratamiento de mastitis debido a su amplio espectro antimicrobiano (24). Usualmente se asocia a macrólidos como la eritromicina o espiramicina (3, 16), para aumentar el espectro de la formulación. También se asocia a la penicilina G, debido a que, teóricamente, ésta refuerza la acción de la neomicina. En el presente estudio se halló un bajo porcentaje de cepas resistentes a la neomicina, concordando con lo informado por otros autores en distintas cuencas lecheras del país (1, 3, 14).

Varios factores, entre ellos la resistencia a los antibióticos, afectan la efectividad de la terapia antimicrobiana frente a S. aureus en mastitis bovina. En general, salvo la penicilina y ampicilina, los antimicrobianos utilizados en este estudio mostraron buena actividad in vitro frente a las cepas de estafilococos coagulasa positivos evaluadas. Si bien los datos de la susceptibilidad in vitro no reflejan necesariamente la actividad del antimicrobiano en la glándula mamaria, la información acerca de la susceptibilidad de los patógenos de mastitis frente a los agentes antimicrobianos puede ser utilizada, en conjunto con otros parámetros, como una guía para la selección de drogas para la terapia de mastitis.

Este trabajo fue financiado con fondos de Fundación ArgenINTA y un subsidio C.A.I.+D. 2000 de la Universidad Nacional del Litoral.

1. Acuña, CN., Chertcoff RE, Cisneros G, Izak E, Nimo JM (2000). Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from quarters with clinical mastitis in Argentina. Proceedings National Mastitis Council Annual Meeting. Atlanta, GE. p. 217-218.

2. Bauer, AA, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M (1966) Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496.

3. Calvinho LF, Vitulich CA, Almeida RA, Canavesio VR, Quaino O (1988) Tratamiento contra mastitis agudas a base de espiramicina. Therios, 11:203-212.

4. Calvinho, LF, Delgado AR, Vitulich CA, Occhi HL, Canavesio VR, Zurbriggen MA, Tarabla HD (1991) Susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos de microorganismos aislados a partir de mastitis clínicas en tambos de la cuenca lechera santafesina. Vet. Arg. 8:677-680.

5. Capurro, A., Concha C, Nilsson L, Östenson K (1999) Identification of coagulase-positive staphylococci isolated from bovine milk. Act. Vet. Scand. 40:315-321.

6. Carter, GR, Chengappa, MM, Roberts, AW (1995). Staphylococcus. En: Carter GR., Chengappa MM, Roberts AW (Eds) Essentials of Veterinary Microbiology Fifth Ed., Williams and Wilkins, Baltimore, p. 115-120.

7. De Oliveira AP, Watts, JL, Salmon SA, Aarestrup FM (2000) Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Europe and the United States. J. Dairy Sci. 83:855-862.

8. Gentilini E, Denamiel G, Llorente P, Godaly S, Rebuelto M, DeGregorio O (2000). Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Argentina. J. Dairy Sci. 83:1224-1227.

9. Hamdy AH, Olds NL, Roberts BJ (1975) Activity of penicillin and novobiocin against bovine mastitis pathogens. Am. J. Vet. Res. 36:259-263.

10. Heer G, Erni L, González A, Bargagna M, Cerutti R (1990) Eficacia del cefacetril en el tratamiento de mastitis clínica bovina. Rev. Med. Vet. (Bs. As.) 71:34-39.

11. Hogan JS, González RN, Harmon RJ, Nickerson SC, Oliver SP, Pankey JW, Smith KL (1999) Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council Inc. Madison, WI. p. 222.

12. National Committee for Clinical Laboratory Standards (1997) Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from animals. Tentative standard. NCCLS Document M31-T. Wayne, PA, Estados Unidos de América.

13. Prescott JF (1999) Antimicrobial Chemotherapy. En: Hirsh DC, Zee YC (Eds), Veterinary Microbiology, Blackwell Science, Inc. Malden, Massachussetts, p. 28-45.

14. Rivero VB, Vena MM, Corbellini CN (1984) Resultados bacteriológicos en casos de mastitis clínicas en rodeos lecheros de la cuenca de abasto del Gran Buenos Aires. Rev. Arg. Prod. Anim. 4:211-223.

15. Roberson, J.R., Fox, L.K., Hancock, DD, Gay JM, Besser TE (1996) Prevalence of coagulase-positive staphylococci, other than Staphylococcus aureus, in bovine mastitis. Am. J. Vet. Res. 57:54-58.

16. Tarabla HD, Calvinho LF, Canavesio VR (2000) Eficacia de una combinación de espiramicina y sulfato de neomicina como tratamiento antibiótico de vaca seca. Therios 29:41-44.

17. Tessi M.A, Alvarez de Esponda R, Sabbatini de Comini L, Giavedoni de Taher MD, Paura A, Moguilevsky MA, Casado N, Romano L, Weidmann P (1979) Etiología microbiana de mastitis bovina subclínica en la cuenca lechera santafesina. Rev. Arg. Microbiol. 11:49-56.

18. Thornsberry C, Marker JC, Watts JL, Yancey RJ (1993) Activity of pirlimycin against pathogens from cows with mastitis and recommendations for disk diffusion tests. Antimicrob. Agents Chemother. 37:1122-1126.

19. Thornsberry C, Burton PJ, Yee YC, Watts JL, Yancey RJ (1997) The activity of a combination of penicillin and novobiocin against bovine mastitis pathogens: development of a disk diffusion test. J. Dairy Sci. 80:413-421.

20. Watts JL, Yancey RJ (1994) Identification of veterinary pathogens by use of commercial identification systems and new trends in antimicrobial susceptibility testing of veterinary pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 7:346-356.

21. Watts JL, Salmon SA (1997) Activity of selected antimicrobial agents against strains of Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infections that produce ?-lactamase. J. Dairy Sci. 80:788-791.

22. Weidmann P, Heer G, Rosset A, Gonzáles A, Weidmann R, Russi N, Erni L (1988) Calidad de leche producida en 25 tambos que aplicaban tecnología avanzada en el Departamento Las Colonias, Provincia de Santa Fe durante el período de Abril de 1984 a Abril de 1985. XIII Congreso Argentino de Producción Animal. Rev. Arg. Prod. Anim. 8 (Supl. 1):134-135.

23. Ziv G, Nouws JFM (1977) Clinical pharmacology of cephacetrile in ruminants. Zbl. Vet. Med. B. 24:798-806.

24. Ziv G (1980) Drug selection and use in mastitis: systemic vs local therapy. J.A.V.M.A. 176:1109-1115.