Giardia duodenalis (sinónimo: Giardia lamblia y Giardia intestinalis), es un protozoario parásito entérico de mamíferos, aves, anfibios y reptiles. En muchos países la giardiasis es la infección intestinal reportada más comúnmente en humanos y en muchos animales domésticos y silvestres1. La transmisión de los animales al ser humano es una gran preocupación y Giardia es una causa importante de brotes de la infección transmitida mediante el agua de bebida1. La giardiasis se asocia con una amplia gama de signos clínicos y su severidad varía desde asintomática hasta la presencia de una severa enfermedad gastrointestinal y alérgica2.

El estado inmunológico del huésped parece influenciar su susceptibilidad a la infección y la severidad de los signos clínicos3.

Los huéspedes sin experiencia inmunológica previa y con algún problema del aparato inmunocompetente son vulnerables a la infección severa y crónica, y algunas personas que viven en áreas endémicas frecuentemente tienen algún grado de resistencia a la infección1,3. Esta información sugiere que la vacunación puede ser una medida de control apropiada para esta enfermedad parasitaria. La inmunoprofilaxis ofrece un método para controlar la infección en poblaciones de alto riesgo, ya sea sintomática o asintomática. Una vacuna efectiva debe ayudar a romper la transmisión fecal-oral y la que ocurre a través del agua de bebida reduciendo la contaminación ambiental. Es altamente deseable contar con vacunas contra este parásito, para uso veterinario, pues la prevalencia en muchos animales domésticos es elevada, las infecciones son clínicamente significativas y la transmisión zoónotica son una grave preocupación. En este articulo hablaremos sobre las bases del desarrollo de las vacunas y sobre la eficacia de las vacunas experimentales y comerciales contra Giardia. Recomendamos a los lectores consultar los artículos de revisión publicados previamente en esta revista, sobre la inmunología contra Giardia3, los antígenos de este parásito4 y su fisiopatólogia5, pues el presente artículo se referirá a dichas áreas sólo en la medida en que se relacionan con las vacunas.

La Repuesta Inmune contra Giardia

Se cree que la inmunidad humoral es importante en la eliminación de los trofozoítos de Giardia del intestino del huésped.

En los animales infectados experimentalmente así como en los humanos infectados durante la fase de eliminación de Giardia, se encuentran niveles elevados de anticuerpos séricos y en las mucosas, y el huésped produce anticuerpos específicos que se encuentran en estos dos sitios, contra los antígenos de Giardia, tanto de la superficie como del citosol3,6,7. En humanos con la infección natural y en ratones infectados experimentalmente, se observan anticuerpos IgM específicos contra Giardia en el suero y en la mucosa intestinal aproximadamente diez días después de la infección y, además, los niveles de IgG e IgA se elevan aproximadamente una semana después, indicando que es posible que los antígenos de Giardia se reconozcan desde el principio de una infección6,7. Los estudios recientes realizados en ovinos, perros y gatos infectados experimentalmente, establecieron que una proporción significativa de los animales no desarrolla elevación en la respuesta de IgG ni IgA contra Giardia7-9.

Esto puede estar asociado con la incapacidad del huésped de reconocer los antígenos del parásito o bien una dificultad en el cambio de clases de inmunoglobulinas de IgM a IgG y a IgA. Parece que el sistema inmune celular no desempeña un papel directo en la eliminación del parásito3.

Los trofozoítos presentes en el intestino delgado murino durante la fase de eliminación de las infecciones están recubiertos por IgG e IgA3. La presencia de anticuerpos monoméricos sugiere que estos anticuerpos logran entrar al intestino durante el curso de la infección, ya sea atravesando el intestino dañado o mediante el transporte de inmunoglobulinas. De hecho, la secreción intestinal de IgA poliméricas, IgA monoméricas, IgG e IgM, se ha demostrado tanto en el tracto intestinal sano como en el enfermo10. Los anticuerpos secretados en la bilis también pueden actuar como una fuente importante de anticuerpos citotóxicos11.

La muerte de los trofozoítos y quistes de Giardia mediada por anticuerpos, es un fenómeno demostrado3. La lisis de los trofozoítos se demostró cuando el parásito se expuso a suero o bilis que contenían anticuerpos policlonales anti-Giardia, o bien dos anticuerpos monoclonales específicos3. Recientemente se demostró que el tratamiento con anticuerpos monoclonales de los trofozoítos en vías de enquistamiento da como resultado la formación de quistes no viables12, lo cual sugiere que la inmunidad humoral puede ser responsable de la liberación de quistes no viables hacia el ambiente, según se ha observado en gatos jóvenes vacunados8.

Los Antígenos de Giardia

Se ha demostrado que existe homogeneidad de las proteínas entre los aislamientos de Giardia recuperados de una amplia variedad de huéspedes mamíferos13 (Figura 1). Dicha homogeneidad se observó a pesar de la heterogeneidad genotípica entre los aislamientos de Giardia14. De hecho, el fenotipo antigénico de los trofozoítos probablemente muestre poca correlación con variaciones en las regiones hipervariables del genoma de Giardia. Ciertos antígenos bien caracterizados son la giardina, las proteínas ricas en cistina, las proteínas del citoesqueleto, las proteínas del shock calórico, las lectinas proteicas de superficie y las proteínas solubles de alto peso molecular4.

Se ha demostrado que existen variaciones en el antígeno de superficie de este parásito, pero hay poca evidencia que sugiera que sea responsable de la cronicidad de las infecciones4. Cuando una población se infecta con la misma cepa o con diferentes cepas de Giardia existe cierta heterogeneidad en el reconocimiento del antígeno, la cual ha sido descrito por algunos investigadores como significativa4 y por otros como de índole menor13. Los antígenos de alto peso molecular de la membrana del citoesqueleto y del citosol son buenos candidatos como antígenos vacunales pues se ha demostrado que son más inmunogénicos13,15. Los antígenos del citosol son importantes en una vacuna contra Giardia puesto que se encuentran en la superficie del parásito y pueden tener actividad como antitoxinas15.

Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de cepas de Giardia duodenalis aislada de un caballo (E1), un mono araña (MK), un perro (D3), un humano (WB) y una oveja (S2). Std: marcadores con peso molecular estándar. Nótese la homogeneidad de los antígenos entre los aislamientos.

Los huéspedes infectados natural y experimentalmente y los animales inmunizados con preparaciones de células completas reconocen a los antígenos comunes de una amplia variedad de aislamientos de Giardia13, lo cual sugiere que sería posible desarrollar una vacuna con una cepa capaz de presentar reacción cruzada con las otras. De hecho, los animales vacunados con una cepa estuvieron protegidos cuando se desafiaron con una cepa distinta9. Se ha especulado sobre la existencia de toxinas putativas de Giardia pero cada vez hay más evidencia de que los trofozoítos de este parásito producen toxinas. La infección causa un acortamiento difuso de las microvellosidades de los enterocitos y esto, a su vez, inhibe la actividad enzimática y el transporte de nutrimentos a través de dichas microvellosidades5, lo cual sugiere la secreción de toxinas de acción difusa sobre la mucosa intestinal. A lo largo de las superficies dorsal y ventral de los trofozoítos se encuentran vacuolas lisosomales, las cuales no se han caracterizado bien todavía pero contienen enzimas hidroliticas16 y posiblemente otras moléculas que podrían actuar como toxinas al ser secretadas a la luz intestinal. Se ha demostrado que los trofozoítos sometidos a ultrasonido y los medios de cultivo después de usados causan aumento en la capacidad contráctil del músculo liso en gerbos y que tienen efecto citotóxico sobre las células ováricas del hámster chino17,18. En otros estudios se demostró que los extractos de trofozoítos sonicados hemolisan los eritrocitos y resultaron citotóxicos para los leucocitos periféricos humanos y para las células HeLa cultivadas19. Se recuperó un extracto de trofozoítos cultivados que causa deficiencia de disacaridasa en animales experimentales, de manera similar a lo observado en infecciones realizadas con fines de investigación5,20. Recientemente se describió un gene que codifica para una proteína similar a la sarafotoxina21. Dicho gene está localizado teloméricamente y por lo tanto está sujeto a efectos de posicionamiento y regulación21. De hecho, Giardia podría producir diversas toxinas que pueden verse influenciadas por las condiciones ambientales dentro del intestino delgado del huésped como la secreción de bilis, antitoxinas y bacterias. La producción de antitoxinas tal vez no elimine necesariamente al parásito, pero sí puede minimizar los signos clínicos o impedir que se presenten. Los animales inmunizados con un extracto de medio ya usado y poseedor de actividad citotóxica, quedaron protegidos contra los signos clínicos pero diseminaron quistes por más tiempo que los animales que recibieron una vacuna con trofozoítos sonicados18. Las toxinas de Giardia o sus toxoides pueden ser componentes importantes de las vacunas pues protegen al huésped contra el desarrollo de algunos signos clínicos.

Vacunas contra Giardia

Existen pocos reportes de estudios con vacunas contra Giardia, a pesar del gran interés que existe en el uso de un enfoque inmunoprofiláctico para controlar la enfermedad. Cuando se inmunizaron ratones BALB/c intraperitonealmente y en los cojinetes plantares posteriores con 106 trofozoítos de G. muris en adyuvante completo de Freund y desafiados con G. muris, cuatro de ocho ratones no diseminaron quistes en las heces, mientras que esto sí ocurrió hasta por ocho semanas22 en los ratones testigos que habían recibido sólo el adyuvante. El mismo protocolo de vacunación no protegió a una estirpe de ratones que era susceptible a la infección crónica (C3H/He)22. Este primer estudio proporcionó evidencia de que las infecciones con Giardia en humanos y animales se pueden prevenir con una vacuna. Vinayak et al. inmunizaron ratones de tres a cuatro semanas de edad (30 animales) subcutáneamente, y lo repitieron siete días después por la vía oral con una vacuna subunitaria de 56 KDa23. Los ratones testigos recibieron sólo solución salina. Todos los animales se desafiaron con 107 trofozoítos de G. duodenalis siete días después de la dosis final inmunizante. Se sacrificaron seis animales en los tiempos postdesafío que se indican a continuación: 3-5, 9-11, 17-21 y 30-35 días. Los trofozoítos se eliminaron de los animales vacunados de 9 a 11 días después del desafío, mientras que los testigos tardaron de 30 a 35 días en eliminar la infección.

Inicialmente se observó un influjo de linfocitos T supresores y una declinación en las células plasmáticas de las mucosas, productoras de IgA, después del desafío de los animales no vacunados, y la inducción de los linfocitos T de ayuda, además de un incremento en las células plasmáticas productoras de IgA e IgG que se asociaron con la eliminación natural del parásito. La vacunación causó una elevación en el número de linfocitos T de ayuda, pero no tuvo efecto sobre el número de linfocitos T supresores. La inmunización también incrementó el número de células plasmáticas productoras de IgA e IgG. En este modelo pareció que la vacuna subunitaria de Giardia fue efectiva.

Se obtuvo una vacuna que contenía 150 mg de proteína, rompiendo los trofozoítos de G. duodenalis cultivados axénicamente (aislamiento de ovino)8,9. Se vacunaron 20 cachorros de gato y 20 cachorros de perro (hembras y machos de 6 a 8 semanas de edad) por la vía subcutánea, aplicando una vacuna de refuerzo 3 semanas después. Diez gatos y diez perros recibieron sólo el adyuvante (testigos de la infección) mientras que tres animales de cada especie no recibieron inyección alguna (testigos no manipulados). Todos los animales, excepto los testigos no manipulados se desafiaron a las cinco semanas después de la vacunación, mediante inoculación intraduodenal de trofozoítos. No se observaron reacciones adversas a la vacuna como fiebre, inflamación, letargia ni anorexia. Los animales no vacunados desarrollaron signos clínicos como diarrea y reducción del peso corporal; no obstante, estos signos no se observaron o se redujeron significativamente, en los vacunados. La vacunación disminuyó la proporción de animales que diseminaron quistes (80% de los gatos y perros no vacunados, 30% de los gatos vacunados y 5% de los perros vacunados), el número de quistes en las heces y su diseminación8,9.

Mientras los gatos vacunados estuvieron diseminando quistes, la viabilidad de los mismos se redujo del 99 al 38% (Referencia 8). Esto podría atribuirse a los efectos citotóxicos directos de los anticuerpos sobre los quistes o a la inactivación de los trofozoítos durante el proceso de enquistamiento, según se describió previamente15. A las tres semanas postdesafío, la proporción de animales con trofozoítos intestinales se redujo significativamente (100% en los perros no vacunados, 60% en los gatos no vacunados, 10% en los perros vacunados y 5% en los gatos vacunados)8,9. También se redujo significativamente el número de trofozoítos por segmento intestinal en los animales vacunados8,9. La vacunación produjo respuestas de IgG e IgA especificas en el suero y en la mucosa, que fueron significativamente mayores que las producidas en los animales no vacunados e infectados (Figura 2a,b)8. Estos estudios mostraron que la vacunación tiene el potencial de proteger a los perros y a los gatos contra la infección y contra los signos clínicos, y generaron el desarrollo de una vacuna comercial.

Se preparó una vacuna comercial contra Giardia (GiardiaVax™, Fort Dodge Animal Health, Overland Park, Kansas, EE.UU.), habiéndose obtenido su registro para uso en perros y gatos en Estados Unidos. Los estudios de eficacia se realizaron en cachorros de perros y gatos de siete semanas de edad (M.E. Olson, Resumen)*. Se inyectaron 40 perros y 40 gatos subcutáneamente, aplicando una segunda dosis de refuerzo tres semanas después. Los animales testigos recibieron un placebo (n=20 de cada especie) que consistió en el adyuvante solamente. Todos los animales se desafiaron por vía oral con quistes de G. duodenalis de origen humano [NF (aislados de un brote originado por el agua de bebida en Botwood, Newfoundland, 1991) en el caso de los perros y WB (Colección Americana de Cultivos Tipo, ATCC 30957: obtenida de un hombre de 30 años de edad con diarrea, en 1979) en el caso de los gatos], aproximadamente seis meses y un año postvacunación. Los animales se observaron diariamente por 42 días después del desafío, en busca de diarrea, cambio de peso corporal, consumo de alimento y quistes en las heces. Después del desafío, menos animales vacunados desarrollaron diarrea y en ellos ésta fue sólo de corta duración, en comparación con los testigos (Cuadros 1 y 2). Los animales testigos perdieron peso corporal mientras que los vacunados continuaron aumentando de peso (desafío a seis meses) o bien el peso no cambió (desafío a doce meses). La vacunación redujo la duración de la diseminación de quistes y el número de los mismos en las heces, en comparación con los testigos. Al final del estudio, todos los animales testigos tenían trofozoítos a todo lo largo del intestino delgado, mientras que no fue posible encontrar esta forma parasitaria en los vacunados. La seguridad en el campo se evaluó en 817 perros que incluyeron 382 cachorros de ocho semanas de edad o menos (H-J. Chu et al., Resumen)=. En el 97% de los perros no se observaron reacciones locales ni sistémicas asociadas con la vacuna. En los animales restantes, sólo se observaron reacciones leves y transitorias en el sitio de la inyección.

No existen reportes del uso de las vacunas contra Giardia como agentes inmuno-terapéuticos. En una investigación no publicada, nosotros vacunamos 13 perros con giardiasis clínica crónica, con duración hasta de dos años, que no era posible tratar con efectividad con metronidazole ni fenbendazole. Los animales respondieron mediante la resolución de los signos clínicos entre los 21 y 35 días, y mediante la no eliminación de quistes entre los 21 y 70 días. Aún cuando tuvimos éxito con la vacuna como agente inmunoterapéutico en estos casos, es necesario ser cautos porque la exposición crónica de la mucosa al antígeno de Giardia tiene el potencial de hacer que los animales no respondan a la vacunación sistémica24. Claramente, hace falta realizar más investigaciones en este campo.

Conclusiones

Las vacunas contra Giardia se han administrado tanto oral como sistémicamente, habiendo obtenido resultados exitosos. Parece que el desarrollo de la inmunidad humoral es crucial para que la vacuna sea eficaz, y que las IgG y las IgA producidas por la inmunización sistémica u oral sean secretadas desde la mucosa del intestino al lumen de este órgano en cantidades suficientes para eliminar al parásito. Las preparaciones elaboradas con trofozoítos completos que contienen proteínas del citosol, el citoesqueleto y la membrana, son altamente efectivas, mientras que ciertas vacunas subunitarias fueron menos efectivas en la eliminación rápida del parásito18. Dado que los anticuerpos citotóxicos inducen la sustitución de los antígenos de superficie específicos de las variantes por nuevos antígenos4, es poco probable que dichos antígenos sean efectivos como vacunas subunitarias. Los principales candidatos como vacunas son los antígenos del citosol que se expresan en la superficie de los trofozoítos, o que se secretan hacia el ambiente circundante y que pueden tener actividad como toxinas. Las vacunas elaboradas con trofozoítos completos rotos, tienen elevadas concentraciones de estos antígenos y son también altamente inmunogénicas8,9 (M.E. Olson, obra citada).

Resulta claro que la inmunoprofilaxis efectiva es benéfica para animales y humanos. Las vacunas deben eliminar al parásito o reducir su presencia en el huésped previniendo así la diseminación de quistes, lo cual puede reducir la transmisión fecal-oral y la contaminación del ambiente, del agua y del alimento. Todo lo anterior debe tener grandes efectos benéficos en los lugares donde la giardiasis es endémica. La vacunación de los animales de compañía y de granja también debe reducir la transmisión zoonótica reduciendo así el contagio inter e intraespecies. Esto es especialmente importante con respecto a las infecciones en los animales de vida libre, en donde el control de la exposición es difícil o imposible de manipular. La vacunación también debe prevenir los signos clínicos como diarrea, pérdida de peso, dolor abdominal y reacciones de hipersensibilidad si se elimina el parásito y si se inactivan las toxinas. Puede ser también especialmente importante evitar las reacciones inmunológicas adversas. Se ha implicado a la giardiasis en casos de alergia de origen alimentario25, sinovitis26 y artritis27, por lo que es importante prevenir la infección para evitar estas enfermedades tan crónicas y difíciles de tratar en animales y humanos. El estímulo inmunológico con una vacuna contra Giardia también puede ser benéfico para la eliminación del parásito o de los signos clínicos de la infección en los animales y para la eliminación de cepas de Giardia resistentes a los quimioterápicos.

Reconocimientos

La ayuda financiera para el desarrollo inicial de la vacuna fue proporcionada a los autores por el Consejo Canadiense de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería. Fort Dodge Animal Health respaldó el desarrollo de la vacuna.

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Fuente: www.fortdodge.com.mx