013. Evaluación de la acción antifungica y antibacteriana in vitro  del Protium cubense  frente a bacterias  de referencias.

Morales Sánchez, Yanelis Dr MVZ1; Fonseca Rodríguez Yunior Dr MVZ1; Peña Ricardo Alfredo DrC2; Zamora Castell Yudith, Lic2

1Universidad de Granma

2 Filial de Ciencias Médicas Bayamo

Contacto: ysanchez@udg.co.cu

UN VETERINARIO ENCOLERIZADO DANTEN, CHARLES

PRINCIPIOS DE FISIOLOGIA ANIMAL. MOYES, CRISTOPHER D.

PATOLOGIA DE LOS ANIMALES DOMESTICOS 3 VOL.

Resumen

El trabajo estuvo encaminado a la comprobación de la acción antifúngica y antibacteriana de las hojas y la corteza del Protium cubense planta endémicas de la región Oriental de nuestro país, que es de amplio uso popular, para ello se obtuvo la tintura y los extractos secos de las partes estudiadas de la planta empleando las normas cubanas aprobadas para estos fines y se determinó además la composición fitoquímica preliminar de cada una de las formulaciones empleadas.

Se comprobó que esta planta tiene una potente acción contra cepas de referencia ATCC de Staphilococcus aureus y Candida albicans.

La eficacia de los extractos de esta planta fue evaluada por comparación con antibióticos modelos actualmente en uso para el sistema de salud.

Abstrac

The work was guided to the confirmation of the action antifungical and antibacterial of the leaves and the bark of the Proteum cubense, endemic plant of the Oriental region of our country, that are of wide popular use, for it was obtained the tinture and the dry extracts of the studied parts of the plant using the cuban norms approved for these ends and it was also determined the preliminary fithoquemical composition of each one of the formulations. It was proven that this plant have a potent action against reference stumps ATCC of Staphilococcus aureus and Candida albicans.

The effectiveness of the extracts of this plant was evaluated by comparison with model antibiotics in use for the system of health.

Materiales y Métodos

Lo primero que se hizo fue seguir la ruta crítica ruta crítica para la investigación científica de los productos naturales. Luego se realizó la selección, identificación y recolección el Protium cubense (Copal Verdadero).

La planta utilizada fue identificadas en el laboratorio de botánica de la Universidad de Granma siguiendo la descripción que se hace en el libro titulado Plantas Medicinales, Aromáticas y Venenosas de Cuba de Juan Tomás Roig y en la Flora de Cuba, los extractos y formulaciones así como el estudio fitoquímico de los mismos se realizó en el Laboratorio de Productos Naturales de la UDG.

Esta planta se recolectó en Buey Arriba en la Zona de Angostura y fueron empleadas la corteza y las hojas de la misma.

Hora: 10: 00 AM -11: 00AM

El Protium cubense en los meses de marzo a mayo, en el momento en que la planta estaba en el estado vegetativo óptimo. Además se sometió al secado al aire libre por 5 días y luego al secado en estufa por 1 hora.

Las formulaciones farmacéuticas se obtuvieron empleando la NR 312 y el Control de Calidad fue hecho según NRSP 313

El PH se determinó según se establece en la NC 90-13-13.

Tamizaje fotoquímico:

Este fue realizado según la metodología para este proceso reportada por (Payo, Sandoval y Peña, 2002) en la monografía “Productos Naturales y su Empleo en la Medicina”

Para desarrollar el tamizaje fitoquímico se informan en la literatura variados esquemas de trabajo que comprenden a su vez el uso de diferentes solventes de extracción.

Es importante señalar que los resultados obtenidos mediante estas técnicas ofrecen solo una visión de la composición química de la planta a estudiar y que no puede tomarse en ninguna caso como un resultado concluyente ya que en la presencia o ausencia de un metabolito pueden influir de forma determinante:

• La época de recolección.

• El estado vegetativo de la planta.

• Las variaciones ocurridas por una deficiente recolección, secado y/o conservación.

• La concentración de los metabolitos.

• La solubilidad en el solvente empleado.

• Las interferencias de otros metabolitos.

• Ensayos biológicos:

La evaluación de la acción antibacteriana y antifúngica se realizó según el protocolo de ensayos in vitro descrito por (Informe 32 OMS y Gavan, T, 1982).

Se utilizaron cepas de referencia ATCC de Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli, Staphilococcus aureus y Candida albicans.

En el Laboratorio Provincial de Higiene y Epidemiología se realizó el ensayo in vitro con los extractos secos del Protium cubense para valorar la determinación de la sensibilidad antimicrobiana de esta frente a estas cepas de referencia.

En este centro se le realizó una especie de antibiograma a esta planta. Luego se procedió a preparar el inóculo, el cual se hizo a partir de un medio de cultivo puro.

Al laboratorio se enviaron 2 muestras M1 y M2 las que representaban al Protium cubense respectivamente. Los extractos secos de la planta se diluyeron con N’N-dimetilformamida , las diluciones que nos propusimos fueron al 100 %, 50 % y al 1 % .

Lectura e interpretación.

La lectura se puede realizar a partir de las 16 h de aplicado el disco hasta las 48 h.

La zona de inhibición es el área que rodea al disco donde el crecimiento ha sido completamente inhibido, sin embargo con las cepas de referencia, la zona puede aparecer invadida aunque se define claramente. No se debe tener en cuenta esta invasión.

Existe un sistema de lectura directa, muy fácil de reproducir, que funde la lectura e interpretación en un solo paso: Se confeccionan laminas circulares transparente con círculos concéntricos cuyos diámetros delimitan zonas que se corresponden con las categorías “ Sensible”, “Intermedio” y “Resistente” que aparecen en la tabla de interpretación de Bauer- Kirby.

Basta con hacer coincidir el disco cuyo halo de inhibición se desee leer con él círculo central de lámina de lectura. El límite de la zona de inhibición, caerá en una de las tres zonas concéntricas.

El halo de inhibición se midió con una Regla VD y se expresó en mm. (Ericson, A.M; Sdigmon, S. J, 1971)

Concentración de los extractos empleados.

Para los ensayos in vitro se emplearon tres niveles de concentración bien diferenciados, del extracto de la planta: extracto puro al 100%, 50% y 1%.

Tratamiento estadístico.

El tratamiento estadístico se realizó empleando el paquete Statistic para Windows, versión 6.0, se empleó el análisis de varianza paramétrico clásico del halo de inhibición respecto a 3 grupos con 3 niveles de concentraciones y un grupo control positivo representado por el halo de inhibición de 3 antibiótico modelo. Este análisis se complemento con un test de newman-keuls, (Stell y Torre, 1992) para la comparación múltiple de medias y fue complementado con un test de Scheffee (J, Sieguel, 1987).

Materiales

Para el montaje del experimento se utilizaron los siguientes materiales:

• Incubadora bacteriológica a 37° C

• Nevera de 2 a 8 ° C

• Hisopo

• Regla VD: 1 mm

• Solución patrón de turbiedad Mc Farland

• Agar de Muller-Hinton

• Caldo de cultivo Muller-Hinton

• Tubos

• Mechero

• Placa petri

• pinzas

Resultados y Discusión

La selección de esta planta se realizó atendiendo al amplio uso popular, a la disponibilidad de la misma y su carácter endémico de Cuba y de la Región Oriental.

Se seleccionaron cepas de microorganismos de referencias ATCC para lograr resultados fiables y comparables con los obtenidos en otros estudios y reportados en la literatura. Se tuvo en cuenta además que estas cepas son las más comunes que se presentan en las enfermedades causadas a enfermos animales y humanos.

Tabla # 1. Resultados del control de calidad de la tintura al 20% del Protium cubense (Copal Verdadero)

Como se observa en la tabla # 1 la tintura al 20% tanto de la corteza y las hojas del Protium cubense, están en los rangos de calidad que establecen las normas para el uso de las formulaciones, tiene un valor de los sólidos totales superior a 3.5 lo que indica una concentración adecuada de principios activos.

La densidad está por encima de 0,90 g/ml y el pH se estabilizó por debajo de 7 lo que indica que son soluciones ligeramente ácidas hecho este que unido al medio alcohólico en que se preparan permite su estabilización y conservación por períodos de tiempos largos.

Esto fue corroborado por el análisis de calidad de las muestras testigos, después de un período de seis meses de reposo sin observarse además la formación de sólidos.

Se comprobó que los parámetros de calidad mostrados en la tabla # 1 mantienen sus valores constantes indicando, que la composición y la calidad de las mismas no varían durante este período, lo que se considera como garantía de calidad para las condiciones del experimento.

Composición fitoquímica de los extractos.

La composición de los extractos empleados se realizó según la técnica reportada por (Payo, Sandoval y Peña, 2002) cuyos resultados se muestran a continuación.

Tabla # 2. Resultados del análisis fitoquímico de la tintura al 20% y los extractos secos.

Como se observa en la tabla # 2 tanto la corteza como las hojas del Protium cubense son muy ricas en metabolitos, destacándose en las hojas un alto contenido de flavonoides, antocianidinas, quinonas y cumarinas y en la corteza cumarinas, azucares reductores, flavonoides y quinonas.

Es importante señalar que el estudio fitoquímico se realizó a la tintura y el extracto seco de ambas partes de la planta demostrándose que la composición de estos se mantiene semejante a la tintura lo cual garantiza que una vez retirado el solvente a la formulación, empleando métodos a baja temperatura como es la roto evaporación no descompone los metabolitos y por tanto las propiedades farmacológicas se deben mantener de forma inalteradas, esto garantiza que los extractos secos y las formulaciones que se preparen a partir de estos tienen la misma composición, es conocida la dependencia que existe entre composición química y propiedades biológicas.

Debe señalarse que tanto en la corteza como en las hojas de la planta no se detectó la presencia de alcaloide a pesar de que las muestras se trabajaron en condiciones de temperaturas que no excedió los 45 ºC, por lo que se puede afirmar la ausencia de este tipo de metabolito en las muestras.

Experimentos in vitro

Las formulaciones obtenidas y validadas se sometieron a experimentación para comprobar la eficacia frente a bacterias y hongos de referencias con el empleo de modelos experimentales validados.

Debe destacarse que en los experimentos realizados se utilizaron los extractos secos obtenidos a partir de la tintura para evitar los efectos de enmascaramiento que pueden producir los solventes y de esta forma poder determinar el efecto verdadero de los extractos sobre las bacterias y hongos estudiados.

Se emplearon tres niveles de concentración de los extractos para cada microorganismo y se empleó el protocolo de ensayos descrito para el desarrollo de antibiogramas del MINSAP (58), para medir el efecto antibacteriano y antifúngico se tomaron los halos de inhibición, se empleó además como referencias el valor de este parámetro para varios antibióticos. Los resultados obtenidos se presentan a continuación.

Grafico 1 Halos de inhibición del Protium cubense (hojas) frente a 4 microorganismos de referencia.

El Gráfico 1 muestra la comparación del halo de Inhibición que producen los extractos del Protium cubense contra las tres cepas de bacterias empleadas y contra la Candida albicans.

Donde se representan valores importantes del halo de inhibición de los extractos (14 y 12mm) frente a Staphilococcus aureus a concentraciones del 100% y 50 % que según la escala de Bauer-Kirby vigente para el MINSAP se clasifica como sensible. Sin embargo para el resto de los microorganismos se obtienen halos de inhibición semejantes.

Debido a los valores de los halos de inhibición de los extractos del Protium cubense frente a Staphilococcus aureus se realizó una comparación con los valores obtenidos para este parámetro que producen varios antibióticos de uso corriente en el tratamiento de enfermedades bacterianas.

Se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos de las hojas del Protium cubense a concentraciones de 100 y 50%, como se muestra en el Gráfico 2.

Gráfico 2 Comparación de los halos de inhibición de diferentes antibióticos y del Protium cubense (hojas) a diferentes concentraciones frente al Staphilococcus aureus.

A una concentración del 100% los extractos no mostraron diferencias significativas, mientras que al 50% el extracto del PCH (Protium cubense hojas) mostró un efecto antibacteriano significativamente superior a la vancomicina y un comportamiento similar a la estreptomicina.

Sin embargo a una concentración del 1% los tres antibióticos ensayados se comportan de una manera similar al compararlos con los extractos del Protium cubense.

Gráfico 3 Halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra 4 microorganismos de referencia

En el Gráfico 3 se representa la comparación de los halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra los cuatro microorganismos.

Al someter estos resultados a un análisis de varianza este obtuvo para un p<0.01, diferencias significativas entre los halos de inhibición de esta y el resto de los microorganismos empleados, así como para todas las concentraciones utilizadas.

Este resultado demuestra la potente acción antibacteriana de las formulaciones obtenidas a partir de la corteza de esta planta.

Al comparar este resultado con los halos de inhibición que producen varios antibióticos a diferentes concentraciones se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos del Protium cubense a concentraciones de 100 y 50%, mientras que a la concentración del 1 existe una diferencia significativamente superior de los extractos del Protium cubense con relación a los demás antibióticos como se muestra en el Gráfico 4.

Gráfico 4 Comparación de los Halos de inhibición de diferentes Antibióticos y del Protium cubense (Corteza) frente al Staphilococcus aureus

A una concentración de 100% y el 50 % los extractos mostraron diferencias significativas con respecto a la tatraciclina a la estreptomicina y la vancomicina, siendo superior su acción frente esta bacteria, mientras que a una concentración del 1% los extractos del PC se comportan de manera superior en comparación con los tres antibióticos ensayados.

Este trabajo ha tenido entre sus finalidades no solo demostrar la acción antibacteriana y antifúngicas de extractos de esta planta sino encontrar entre los nuevos productos ensayados, cual es el de mejor perfil de acción contra cada microorganismo, para lo cual se ha realizado la comparación de cada uno de ellos en cada una de las concentraciones ensayadas experimentalmente y con el empleo de varios antibióticos como control.

Conclusiones

• Luego de concluido el trabajo experimental y atendiendo a los resultados obtenidos se ha llegado a las siguientes conclusiones.

• Se obtuvo la tintura y los extractos secos de la corteza y las hojas del Protium cubense, determinando las especificaciones de calidad de la tintura, se determinó la composición fitoquímica preliminar de cada una de las partes estudiadas y se comprobó que en las hojas predominan antocianidinas, cumarinas, flavonoides y quinonas y en la corteza la contienen además de los tres últimos, azúcares reductores.

• Se demostró que la composición de la tintura al 20% del Protium cubense es semejantes a la composición de los extractos secos.

• Se demostró que los extractos del Protium cubense tiene una potente acción antibacteriana contra Staphilococcus aureus. Mientras que se mostró inactivo frente a Pseudomona aeruginosa y Escherichia coli.

Recomendaciones

• Emplear formulaciones de corteza y hojas del Protium cubense contra enfermedades producidas por Staphilococcus aureus y C. albicans.

• Realizar estudios de toxicidad aguda a los extractos de las plantas estudiadas.

• Ampliar los estudios in vitro a otros microorganismos.

• Realizar estudios in vivo para corroborar las observaciones realizadas in vitro.

Literatura

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• Stell R.G. D. y J. H. Torre. Biostatistics Principles and procedures. 2ed. Mc Grawhill, Interamericana de México, S.A. Mellrog SG, Thompson. 1992 .

Fuente: VET-UY - Material remitido por Dra. MVZ. Yanelis Morales Sánchez - Profesora de Zoohigiene Tropical - Departamento de Sanidad Animal - Facultad de Medicina Veterinaria - Universidad de Granma - Cuba

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