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 ISSN 1688-2075

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092. Diagnóstico de la infección y del aborto causado por Neospora caninum en los bovinos.

Ignacio Ferre, Gema Álvarez-García, Esther Collantes-Fernández, Francisco José Pérez-Zaballos y Luis Miguel Ortega-Mora

Departamento de Sanidad Animal

Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid

Publicado en Producción animal, Julio 2003

Imagen de tapa no disponible ISBN: 9874371870
Libro: ENFERMEDADES INFECCIOSAS DE LOS RUMIANTES
Autor: FEDERICO J. LUCHTER

Neospora caninum es considerado el agente etiológico causante de aborto más importante en los principales países productores de ganado bovino. En este trabajo se revisan los métodos de diagnóstico que se utilizan habitualmente en la neosporosis bovina, así como los avances más recientes en técnicas serológicas y de biología molecular.

INTRODUCCIÓN

Neospora caninum es un protozoo apicomplejo, estrechamente emparentado con Toxoplasma gondii, que forma quistes tisulares en sus hospedadores (se describe detalladamente en Dubey et al. 2002). En relación con su ciclo biológico, el perro actúa como hospedador definitivo e intermediario (McAllister et al. 1998), mientras que vacas, ovejas, caballos, cabras, zorros, coyotes, ciervos, búfalos y camellos son sus hospedadores intermediarios naturales; y gatos, ratones, ratas, gerbos y monos pueden ser hospedadores intermediarios experimentales (Dubey 1999).

En infecciones naturales se han identificado tres estadios del parásito: taquizoítos, bradizoítos y ooquistes (Dubey y Lindsay 1996, Basso et al. 2001). Los taquizoítos y los quistes tisulares que contienen los bradizoítos son estadios propios de los hospedadores intermediarios. Los taquizoítos, asociados a la fase aguda y fenómenos de recrudescencia de la neosporosis, pueden multiplicarse virtualmente en cualquier tipo celular, mientras que los quistes tisulares, asociados a la fase crónica de la infección, se encuentran principalmente en el sistema nervioso central. Los perros pueden eliminar en sus heces ooquistes resistentes a las condiciones ambientales, los cuales adquieren la capacidad infectante aproximadamente a las 24 horas de su eliminación (Lindsay et al. 1999).

Las rutas de transmisión del parásito incluyen la transplacentaria y la ingestión, bien de tejidos que porten quistes tisulares o de esporozoítos contenidos en los ooquistes esporulados. La infección por N. caninum origina trastornos musculares, parálisis y mortalidad en los perros; y abortos y morbilidad neonatal en vacas, ovejas, cabras, caballos y ciervos (Dubey y Lindsay 1996, Dubey 1999).

LA NEOSPOROSIS BOVINA

La neosporosis bovina se diagnosticó por primera vez en un rebaño de Nuevo Méjico con historial de abortos persistentes (Thilsted y Dubey 1989). Se han publicado diversas revisiones sobre la neosporosis bovina que pueden consultarse (Dubey y Lindsay 1996, Dubey 1999, Ortega-Mora et al. 1999, Anderson et al. 2000).

Distribución y frecuencia

La infección por N. caninum en el ganado vacuno tiene distribución mundial y los estudios epidemiológicos realizados muestran tasas de prevalencia elevadas, tanto individuales como de rebaño y tanto en sistemas de producción lecheros como de carne. Actualmente, la neosporosis se considera como la principal causa de aborto en el ganado lechero de Estados Unidos, Nueva Zelanda, Europa, Centro y Sur America y probablemente Asia (Dubey y Lindsay 1996, Dubey 1999, Hempill y Gottstein 2000, Morales et al. 2001, Corbellini et al. 2002, Kim et al. 2002, Moore et al. 2002). En el Reino Unido, una estimación teórica atribuye a N. caninum 12,5% del número total de abortos bovinos (Davison et al. 1999a).

En España, un estudio reciente realizado por nuestro grupo de investigación (Pereira-Bueno et al. 2003), muestra que hasta 38,8% de los fetos bovinos analizados -procedentes de Galicia, Asturias y Castilla-León- se consideraron infectados por N. caninum (Cuadro 1). En un trabajo previo, donde investigamos la presencia de anticuerpos específicos frente a N. caninum en 216 rebaños bovinos de carne y 143 rebaños de leche del noroeste español, se encontró una tasa de prevalencia de 17,9% y 35,9% respectivamente (Quintanilla-Gozalo et al. 1999). La frecuencia de infección fetal por N. caninum es también elevada en otros países europeos como Suiza (21%) (Sager et al. 2001), Francia (17-45%) (Pitel et al. 2001) y Holanda (17%) (Wouda et al. 1997a).

Cuadro 1.- Selección de trabajos recientes sobre la infección por Neospora caninum en fetos bovinos abortados utilizando diferentes técnicas de diagnóstico (histopatología, inmunohistoquímica, serología y PCR). Los resultados se ofrecen como porcentajes.

País

n

HP

IHCa

Serología

PCR

Total

Referencia

España

80

31,3

53,8

10,7

15,3

38,8

Pereira-Bueno et al. 2003

España

130

44

50

51

 

32-57

González et al. 1999

Francia

104

 

 

 

21,2

 

Pitel et al. 2001

Reino Unido

324

4

23,1

10,5

13

0,9-2,4

Schock et al. 2000

Suiza

83

75b

 

8,4

29

 

Gottstein et al. 1998

Suiza

242

84b

 

 

21

 

Sager et al. 2001

Corea

180

25

35,6

21,1

76,6c

21,1

Kim et al. 2002

Argentina

188

22,8

67,4

24,6

 

 

Moore et al. 2002

Brasil

47

46,8

81,8

 

 

 

Corbellini et al. 2002

Méjico

211

34,6

77

 

 

 

Morales et al. 2001

a) IHC en fetos con HP compatible.

b) HP en muestras positivas por PCR.

c) PCR en fetos con HP compatible.

Por su elevada tasa de prevalencia en el ganado bovino, N. caninum se considera en la actualidad como uno de los agentes etiológicos más importante del aborto transmisible bovino y a la neosporosis como una enfermedad con gran impacto económico en la industria ganadera (Trees et al. 1999).

Transmisión

La transmisión congénita de N. caninum se considera la forma más importante de mantenimiento y difusión de la neosporosis. Numerosos trabajos demuestran que la transmisión transplacentaria del parásito es muy eficaz en los bovinos infectados naturalmente, oscilando entre 72 y 95% (Schares et al. 1998, Wouda et al. 1998, Davison et al. 1999b, Dubey 1999). Sin embargo, hemos podido comprobar que en rebaños bovinos infectados endémicamente del noroeste español la frecuencia de la transmisión vertical es menor (48%) a la descrita en Norteamérica y otros países europeos, a pesar que la principal vía de transmisión de N. caninum en estos rebaños es la congénita (Pereira-Bueno et al. 2000) y la seroprevalencia de la infección en la población adulta elevada (Quintanilla-Gozalo et al. 1999).

La transmisión congénita repetida en hembras con infección crónica es posible en gestaciones sucesivas y los terneros permanecen infectados de por vida (Dubey y Lindsay 1996, Schares et al. 1998, Wouda et al. 1998a, Davison et al. 1999b, Dubey 1999). Otras formas de transmisión vertical, como por ejemplo mediante el calostro o la leche podrían ser también posibles (Uggla et al. 1998), pero todavía no se han demostrado en animales infectados naturalmente.

Los modelos matemáticos de simulación indican que solamente la transmisión vertical no es suficiente para mantener la infección en los rebaños bovinos (French et al. 1999) y los estudios epidemiológicos indican la existencia de la transmisión horizontal (Thurmond et al. 1997, Davison et al. 1999b, Hietala y Thurmond 1999, Dijkstra et al. 2001, 2002).

Se ha podido comprobar que los terneros (De Marez et al. 1999) y las vacas gestantes (Trees et al. 2002) pueden infectarse experimentalmente con ooquistes de N. caninum eliminados por el perro, cuando estos se administran por vía oral. Sin embargo, el número de ooquistes eliminados en las heces de perros infectados experimentalmente con ratones con neosporosis crónica es escaso, excepto cuando se les somete a un tratamiento inmunosupresor (McAllister et al. 1998, Lindsay et al. 1999) y, por ello, se ha dudado de la importancia epidemiológica relativa de las infecciones bovinas mediante ooquistes (Davison et al. 1999b). Sin embargo, recientemente se ha reproducido experimentalmente el ciclo de transmisión perro-ternero (Gondim et al. 2002) y se ha demostrado que los perros (hospedadores definitivos) infectados mediante la ingestión de tejidos de bovinos (hospedadores intermediarios naturales) con neosporosis crónica eliminaban una mayor cantidad de ooquistes del parásito en sus heces que aquellos infectados con tejidos murinos (hospedadores intermediarios experimentales).

 

DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS BOVINA

El diagnóstico de la neosporosis bovina es difícil debido a la inexistencia de manifestaciones clínicas en los animales infectados crónicamente y al escaso número de parásitos en los fetos abortados (Jenkins et al. 2002). Por ello, la confirmación de la infección requiere la asistencia de un laboratorio de diagnóstico veterinario. Actualmente, el diagnóstico de la neosporosis bovina se basa en la detección de anticuerpos específicos frente al parásito en los bovinos adultos (Björkman y Uggla 1999) y la observación de lesiones compatibles en el cerebro, corazón e hígado de fetos abortados, combinado con el examen inmunohistoquímico (Barr et al. 1990, 1991, Anderson et al. 1991, González et al. 1999, Morales et al. 2001) y la detección de ADN de Neospora mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Gottstein et al. 1998, Baszler et al. 1999, Sager et al. 2001, Pitel et al. 2002, Pereira-Bueno et al. 2003) en tejidos fetales; y la serología fetal (Barr et al. 1995, Reichel y Drake 1996, Buxton et al. 1997, Wouda et al. 1997a).

 

DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POSTNATAL POR N. caninum

Las vacas que han abortado no muestran manifestaciones clínicas y éstas solo se han observado en terneros menores de dos meses de edad. Los terneros infectados por N. caninum pueden nacer con menos peso del esperado, ser incapaces de levantarse y presentar manifestaciones nerviosas (casos revisados en Dubey y Lindsay 1996). Las extremidades (con más frecuencia las posteriores) pueden estar flexionadas o hiperextendidas y el examen neurológico puede revelar ataxia, disminución del reflejo patelar y pérdida de la consciencia proprioceptiva. También pueden presentar exoftalmia y la apariencia asimétrica de los ojos. Sin embargo, debe destacarse que estos casos son muy infrecuentes y que la gran mayoría de los terneros infectados congénitamente nacen clínicamente normales.

Pruebas serológicas

Las técnicas serológicas -que detectan anticuerpos séricos específicos frente a N. caninum- se utilizan habitualmente para demostrar la infección en los bovinos adultos y en el rebaño, permiten conocer si la neosporosis es causa del fallo reproductivo comparando la prevalencia de la infección en las vacas que abortan y en aquellas que no lo hacen (Thurmond y Hietala 1995). La transmisión congénita también se ha evaluado mediante la determinación de anticuerpos frente a N. caninum en el suero precalostral de terneros recién nacidos, puesto que en los bovinos no existe transferencia de anticuerpos de la madre al feto durante la gestación (Paré et al. 1996, Thurmond y Hietala 1997). Sin embargo, aunque un resultado serológico positivo ayuda a identificar un animal adulto infectado, un resultado negativo no descarta definitivamente la infección porque los anticuerpos séricos frente a N. caninum pueden fluctuar con la edad y el estado de gestación (Pereira-Bueno et al. 2000, Quintanilla-Gozalo et al. 2000).

Para detectar anticuerpos específicos frente a N. caninum se han desarrollado diferentes pruebas serológicas cuyos fundamentos y características han descrito Björkman y Uggla (1999) y Atkinson et al. (2000a). Las técnicas serológicas más utilizadas en el diagnóstico de la neosporosis bovina son la inmunofluorescencia indirecta (IFI) (Paré et al. 1995, Björkman y Uggla 1999, Atkinson et al. 2000a, 2000b, Morales et al. 2001) y varios ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) (Björkman y Uggla 1999, Schares et al. 1999a, 2000, 2002, Baillargeon et al. 2001, Baszler et al. 2001, Rebordosa et al. 2001, Chalun et al. 2002, Howe et al. 2002, Reichel y Pfeiffer 2002, Álvarez-García et al. 2003, Sager et al. 2003).

La IFI fue la primera técnica serológica aplicada a la neosporosis y frecuentemente ha sido utilizada como prueba de referencia. Las pruebas ELISA, usando muestras de suero o leche, carecen de la subjetividad de la IFI y al poder automatizarse permiten un análisis más rápido de las muestras y las hace muy útiles en el caso de estudios epidemiológicos a gran escala. Para mejorar la especificidad de las pruebas ELISA tradicionales, basadas en el uso de antígeno completo o extractos solubles de taquizoítos, se han utilizado taquizoítos enteros, complejos estimulantes de la inmunidad (iscoms), antígenos recombinantes y antígenos purificados por afinidad. Por otra parte, se han desarrollado varias pruebas ELISA de avidez que permiten distinguir entre las fases aguda y crónica de la neosporosis (Björkman y Uggla 1999, Schares et al. 2002, Sager et al. 2003).

Recientemente, también se han normalizado las pruebas de aglutinación directa (Björkman y Uggla 1999), cuyas ventajas son su simplicidad y no requerir anticuerpos secundarios específicos. El diagnóstico de la neosporosis bovina se ha facilitado con la comercialización de diferentes pruebas ELISA que permiten la detección de anticuerpos séricos frente a N. caninum.

Actualmente, los antígenos utilizados en las pruebas serológicas proceden de taquizoítos obtenidos en cultivos celulares de aislados bovinos y caninos de N. caninum. Mediante inmunoblot se han identificado antígenos inmunodominantes de 17, 29/30, 37 y 46 kDa y proteínas con un peso molecular de 25, 65 y 116 kDa en el suero de bovinos infectados naturalmente (Baszler et al. 1996, Atkinson et al. 2000a, 2000b, Söndgen et al. 2001, Álvarez-García et al. 2002). Sin embargo, el inmunoblot no se ha utilizado como un método corriente de diagnóstico, sino como técnica confirmatoria de otras pruebas serológicas (Atkinson et al. 2000a, 2000b, Söndgen et al. 2001). Así, el reconocimiento de tres o cuatro antígenos inmunodominantes de 17, 29/30, 37 y 46 kDa por el suero de vacas infectadas naturalmente se ha considerado como confirmación de la infección (Schares et al. 1998). Además, cuando el inmunoblot se utiliza para analizar fluidos fetales, se ha comprobado que incrementa significativamente la sensibilidad de la serología fetal (Söndgen et al. 2001).

En nuestro laboratorio hemos comparado el patrón de reconocimiento de antígenos de taquizoítos de Neospora por novillas y vacas que habían o no abortado durante la gestación (Álvarez-García et al. 2002). La diferencia más sobresaliente entre las vacas que había abortado y las que no lo habían hecho fue la mayor intensidad de reconocimiento de un antígeno de 17-18 kDa por las vacas que habían abortado. Esta proteína podría tener una aplicación importante en el diagnóstico y la inmunoprofilaxis de la neosporosis bovina.

En el futuro, el conocimiento del patrón de reconocimiento específico de taquizoítos y bradizoítos podría ser muy útil para distinguir entre las fases aguda y crónica de la infección por N. caninum.

Validación de las pruebas serológicas

Es frecuente que las pruebas serológicas mencionadas se utilicen tanto para evaluar abortos sospechosos de neosporosis como para identificar bovinos infectados de diferente edad y sexo. Sin embargo, se han realizado pocos estudios que comparen y evalúen críticamente las diferentes técnicas serológicas utilizadas corrientemente en el diagnóstico de la neosporosis bovina. Dos aspectos que deberían considerarse en la validación de estas pruebas son la selección apropiada de la población de referencia y las estrategias de muestreo.

Para establecer la población de referencia se han considerado diferentes aspectos como la presencia de anticuerpos específicos precalostrales en el ternero recién nacido (como indicador de la infección de la madre asumiendo la gran eficacia de la transmisión congénita), la utilización simultánea de dos pruebas serológicas para confirmar la infección y el uso de la IFI como prueba de referencia. La primera consideración podría ser errónea porque no siempre la eficacia de la transmisión vertical observada en condiciones naturales es elevada, como ya se ha descrito en algunos rebaños infectados endémicamente del noroeste español (Pereira-Bueno et al. 2000) y, además, por el hecho que en modelos de infección experimental, vacas infectadas antes de la gestación y que mostraron títulos de anticuerpos específicos durante la gestación, no transmitieron la infección a su descendencia (Innes et al. 2001). Por otra parte, el uso de la IFI como prueba de referencia parece no ser suficientemente seguro en un estudio de validación porque todavía no hay consenso en los puntos de corte respecto a la serología de adultos y fetos entre los distintos laboratorios de diagnóstico y porque la IFI no puede resolver reacciones positivas poco claras o poco específicas. En estos casos, la utilización del inmunoblot -más específico- permitiría un diagnóstico inequívoco (Söndgen et al. 2001).

La sensibilidad y la especificidad de una prueba diagnóstica pueden variar por diversos factores, como la edad del animal o la fase de la infección. Recientemente, hemos investigado la influencia de la edad (fetos, novillas y vacas) y el propósito de la prueba diagnóstica (detección de la infección o del aborto) sobre la selección del punto de corte para dos de las técnicas de diagnóstico más utilizadas en la neosporosis bovina, la IFI y una prueba ELISA comercial de antígeno completo del taquizoíto (Álvarez-García et al. 2003). Los resultados obtenidos confirman la homogeneidad de la población de reproductoras compuesta por novillas y vacas y la utilización de diferentes puntos de corte para fetos y reproductoras. Desde un punto de vista práctico y en ausencia de un punto de corte perfecto para las reproductoras infectadas, la utilización de un valor de punto de corte para máxima sensibilidad podría ser interesante para investigar el estado individual de animales antes de la compra o a la entrada en un rebaño libre de Neospora. Por el contrario, un punto de corte para máxima especificidad podría ser útil cuando se evalúa la presencia de la neosporosis en un área determinada (estudios epidemiológicos). Para propósitos intermedios, se aconseja la utilización de una prueba confirmatoria como el inmunoblot, basado en el reconocimiento de uno o varios antígenos inmunodominantes del taquizoíto por el suero problema.

 

DIAGNÓSTICO DEL ABORTO CAUSADO POR N. caninum

El aborto es el único síntoma observado en las vacas infectadas por N. caninum y los fetos pueden morir en el útero, ser reabsorbidos, momificarse o autolizarse. Pueden abortar vacas de cualquier edad desde los tres meses de gestación hasta término y una vaca puede abortar repetidamente en gestaciones sucesivas. Los abortos pueden ser esporádicos, endémicos y epidémicos (Dubey y Lindsay 1996, Dubey 1999, Anderson et al. 2000).

La historia clínica y los datos epidemiológicos pueden ser orientativos (Cuadro 2), pero el diagnóstico definitivo de la neosporosis precisa del examen del feto en un laboratorio de diagnóstico equipado adecuadamente. Las muestras diagnósticas incluyen el feto abortado que debe ser enviado con la placenta y suero de la madre. Si esto no es posible, entonces deben enviarse muestras de cerebro, corazón e hígado fetales. Las muestras de suero pueden obtenerse del fluido serosanguinolento acumulado en las cavidades corporales fetales. El diagnóstico laboratorial se realiza mediante el examen histopatológico del feto, técnicas de PCR y serología de la madre y del feto (Cuadro 3).

Cuadro 2.- Protocolo de estudio de un problema de abortos en una explotación de vacas de leche (Kinsel 2002).

1. Confirmar la magnitud del problema

¿Ha aumentado la incidencia anual de abortos en la granja?

¿Nos enfrentamos ante un brote de abortos?

2. Acudir a los registros de la explotación

Recoger datos de las vacas abortadas y de las no abortadas

Nº de identificación, nº de lactación, datos reproductivos y de partos, diagnóstico de gestación, inseminaciones, fechas de aborto, valor de la vaca, historial sanitario.

Recoger datos sobre el manejo de la granja

Llegada de animales, historial de vacunaciones, instalación y manejo de los parques, manejo reproductivo, agrupamiento de animales, nutrición, sanidad, política de desvieje.

3. Confeccionar una lista retrospectiva de los sucesos que hayan ocurrido en la granja hasta 3-6 meses antes del comienzo del problema

Llegada de nuevos animales, cambios en la nutrición, vacunaciones, enfermedades, cambios en el manejo, calidad y cantidad de leche en tanque.

4. Procesar los datos

Relacionar los sucesos ocurridos en la granja y los resultados productivos de leche en tanque con el comienzo de los problemas de aborto.

5. Realizar la comparación de las vacas caso y control

Comparar los historiales de las vacas que abortan con las gestantes que no abortan.

En el caso de la neosporosis bovina, Sager et al. (2001) realizan un estudio caso-control en Suiza y Thurmond & Hietala (1995) ofrecen un enfoque epidemiológico para el diagnóstico de la neosporosis en el rebaño.

6. Recoger muestras de las vacas del grupo de riesgo

Recoger un número de muestras representativo (mínimo 10 muestras de sangre).

 

Cuadro 3.- Diagnóstico del aborto causado por Neospora caninum en los bovinos.

PROBLEMA

VACA ABORTADA

MUESTRAS

Suero

TÉCNICA

IFI, ELISA

RESULTADO

Negativo

Positivo

CONCLUSIONES

Vaca no infectada

Problema: ¿existe fluctuación de anticuerpos?

Indica exposición a N. caninum

¿Ha participado N. caninum en el aborto?

A) Individual: ELISA de avidez (infección aguda/crónica)

Problema: ¿recrudescencia?

B) Rebaño: la seropositividad en vacas abortadas es mayor que en vacas no abortadas

 

PROBLEMA

FETO ABORTADO

MUESTRAS

Suero

Órganos

(cerebro, corazón, hígado, etc)

TÉCNICA

IFI, ELISA, IB

Examen histopatológico

RESULTADO

Negativo

Positivo

Negativo

Positivo

CONCLUSIONES

No descarta la participación de N. caninum

a) falta de inmunocompetencia fetal

b) intervalo de tiempo corto entre infección y aborto

c) autolisis y degradación de Ig

Existe infección fetal

Confirmar mediante HP

No se observan lesiones compatibles

Confirmar mediante serología maternal y fetal

Existen lesiones compatibles

Problema: sarcocystiosis y otras

Confirmar mediante la detección de N. caninum

IHC: poco sensible, problemas con fetos autolíticos

PCR: muy sensible y específica, eficaz con fetos autolíticos

Aislamiento: lento y laborioso

 

Histopatología y detección del parásito

El método más corriente para diagnosticar la infección por N. caninum en fetos bovinos abortados es el examen histopatológico de los tejidos fetales, identificando, a continuación, al parásito en la zona lesionada (Cuadro 1).

Las lesiones macroscópicas son poco frecuentes en los abortos por Neospora, pero en ocasiones pueden observarse líneas blanquecinas en los músculos esqueléticos y en el corazón y pequeños focos, pálidos u oscuros, en el cerebro (Dubey y Lindsay 1996, Anderson et al. 2000). Histológicamente, pueden observarse lesiones inflamatorias degenerativas en todos los tejidos fetales, pero con más frecuencia en el sistema nervioso central, corazón, musculatura esquelética e hígado (revisado en Dubey y Lindsay 1996). Las lesiones diagnósticas más significativas se encuentran en el cerebro y consisten en una encefalomielitis no supurativa caracterizada por infiltraciones multifocales no supurativas, con o sin necrosis multifocal. Otras lesiones histológicas que pueden observarse frecuentemente incluyen miocarditis no supurativa, miositis focal no supurativa y hepatitis portal no supurativa, frecuentemente con necrosis hepática focal y neumonía focal intersticial no supurativa.

Las lesiones fetales típicas, como la encefalitis y miocarditis multifocales no supurativas, no son patognomónicas, pero la sensibilidad y especificidad de la histopatología fetal fetal es elevada y puede realizarse un diagnóstico presuntivo cuando se observan lesiones compatibles (Wouda et al. 1997b). La histopatología se ha utilizado como técnica de referencia (Baszler et al. 1999), aunque es necesario siempre confirmar la presencia del parásito porque otros protozoos, como diversas especies del género Sarcocystis, podrían causar lesiones similares (Jenkins et al. 2002). El método más frecuentemente utilizado para la detección de N. caninum es la inmunohistoquímica (IHC) del cerebro y otros tejidos fetales como el pulmón, hígado y corazón (Lindsay y Dubey 1989). Sin embargo, la IHC es una técnica poco sensible para detectar parásitos en el feto, debido a que existen en escaso número en los tejidos afectados y porque la demostración de los antígenos de Neospora mediante IHC depende del número de cortes histológicos realizados y del tiempo invertido en examinarlos (Wouda et al. 1997b). Además, el estado frecuentemente autolítico de los fetos puede disminuir la precisión diagnóstica. Esta falta de sensibilidad es una de las razones por las que la IHC no ha sido considerada como una técnica útil en el diagnóstico de la neosporosis fetal.

Por otra parte, el aislamiento de N. caninum en cultivos celulares o mediante inoculación en ratón no es adecuado para el diagnóstico habitual porque en los fetos bovinos muchos parásitos mueren por la autolisis celular. Recientemente, se han desarrollado diversas técnicas de biología molecular para la detección del ADN de Neospora.

Técnicas de PCR

Se han desarrollado varios métodos de PCR que amplifican el fragmento ITS1 (Payne y Ellis 1996) y la secuencia del gen pNc5 (Kaufmann et al. 1996) de Neospora con diferentes modificaciones, como las PCR anidadas o semianidadas, intentando con ello incrementar la sensibilidad y especificidad de la técnica (Kaufmann et al. 1996, Ellis 1998, Baszler et al. 1999). Las técnicas de PCR son útiles para detectar el parásito en los tejidos de fetos bovinos abortados (Gottstein et al. 1998, Baszler et al. 1999, Ellis et al. 1999, Schock et al. 2000, Sager et al. 2001, Pitel et al. 2001, Pereira-Bueno et al. 2003). Las ventajas de esta técnica son su elevada especificidad y sensibilidad y la capacidad de amplificar pequeñas cantidades de ADN de N. caninum en una gran variedad de tejidos. Además, la PCR funciona bien cuando los fetos se encuentran autolíticos, lo que es frecuente en el caso del aborto por Neospora.

Actualmente, se han descrito dos técnicas de PCR que cuantifican la presencia de N. caninum en tejidos. Liddell et al. (1999) han desarrollado una técnica de tipo cuantitativo-competitivo, muy laboriosa, de bajo rendimiento y que requiere un análisis posterior. En nuestro laboratorio hemos desarrollado una PCR cuantitativa específica basada en la secuencia genómica Nc5 de N. caninum (Collantes-Fernández et al. 2002), cuya utilidad se ha evaluado satisfactoriamente en fetos bovinos abortados. La cuantificación del parásito en los diferentes tejidos del hospedador ayudaría en un futuro próximo en la investigación de la patogenia y en la evaluación de vacunas o fármacos para controlar la neosporosis bovina.

 

Serología maternal y fetal

La detección de anticuerpos frente a N. caninum en el suero o fluidos fetales mediante IFI (Conrad et al. 1993, Paré et al. 1995, Otter et al. 1997, Slotved et al. 1999) o ELISA (Paré et al. 1995, Slotved et al. 1999) indica infección fetal porque no existe transmisión transplacentaria de anticuerpos de la madre al feto. Sin embargo, varios trabajos han demostrado la baja sensibilidad de la serología fetal (Barr et al. 1995, Reichel y Drake 1996, Wouda et al. 1997a, Gottstein et al. 1998, Slotved et al. 1999), a pesar que puede ser mejorada utilizando el inmunoblot (Söndgen et al. 2001), porque un resultado negativo no asegura la inexistencia de infección por N. caninum. Esto puede ser debido a la falta de inmunocompetencia fetal (fetos de menos de cuatro meses), al transcurso de un intervalo de tiempo corto entre la infección y la muerte fetal o a la autolisis fetal que puede degradar las inmunoglobulinas y de esta manera disminuir la cantidad de anticuerpos específicos. Por otra parte, la detección de anticuerpos de Neospora en los fluidos fetales no demuestra que la infección haya causado la muerte fetal, porque la mayoría de terneros con anticuerpos precalostrales son clínicamente normales. Por ello, la serología fetal no puede usarse como única prueba diagnóstica para confirmar el aborto por N. caninum en fetos aislados.

La presencia de anticuerpos específicos en el suero de vacas abortadas es solo indicativa de la exposición a Neospora y, por ello, un resultado negativo no puede excluir a la neosporosis como causa del aborto. Las vacas que abortan fetos infectados por N. caninum generalmente tienen títulos de anticuerpos elevados (Otter et al. 1997, Wouda et al. 1998b), pero los anticuerpos pueden fluctuar y disminuir rápidamente después del aborto (Conrad et al. 1993, Schares et al. 1999b). Sin embargo, dos trabajos muestran que la cinética de la respuesta de anticuerpos frente a Neospora durante la gestación puede ser una herramienta muy útil para predecir el aborto o la transmisión vertical de N. caninum a la descendencia en vacas infectadas crónicamente (Paré et al. 1997, Quintanilla-Gozalo et al. 2000). La determinación del título de anticuerpos específicos en una sola muestra recogida de cada una de las vacas del rebaño en el momento de la inseminación y/o diagnóstico de gestación podría ayudar a predecir hasta 61-68% de futuros posibles abortos (Quintanilla-Gozalo et al. 2000).

 

Perspectivas futuras

En un trabajo reciente hemos evaluado el valor de las técnicas más utilizadas para el diagnóstico de la neosporosis en fetos bovinos, como la histopatología, IHC, serología (IFI y ELISA) y PCR (Pereira-Bueno et al. 2003). Cuando se compararon la histología, PCR y serología, la escasa concordancia observada subraya la necesidad de utilizar técnicas diferentes y complementarias si queremos incrementar la probabilidad de detectar la infección por N. caninum en un feto abortado. Sin duda, se necesitan más trabajos que cuantifiquen las características operativas de las pruebas utilizadas habitualmente y, sobre todo, definir la metodología de muestreo. Una característica común en todas las pruebas diagnósticas estudiadas es su falta de sensibilidad, aunque todas ellas han demostrado ser altamente específicas. Los criterios diagnósticos para definir una infección fetal y el aborto asociado a Neospora necesitan definirse y basarse no solo en la demostración de la infección fetal, sino también, como ya se ha sugerido (Anderson et al. 2000, Jenkins et al. 2002), en la extensión e intensidad de las lesiones en el feto, la edad fetal y el estatus serológico de la neosporosis en el rebaño.

Finalmente, en un futuro próximo, es necesario el abordaje y desarrollo de diversas líneas de investigación, entre otras, la validación y normalización de las pruebas serológicas utilizadas habitualmente (IFI y ELISA) entre los diferentes laboratorios de diagnóstico, la descripción de antígenos específicos de estadio y el desarrollo de pruebas ELISA de avidez que permitirían discriminar entre infecciones recientes y crónicas, y la inclusión de las técnicas de PCR en el diagnóstico habitual de la neosporosis bovina. En este sentido, una interesante iniciativa ha sido la reciente puesta en marcha bajo los auspicios de la Unión Europea de la Acción COST-854, titulada "Protozoal Reproduction Losses in Farm Ruminants" y que tiene como objetivo, entre otros, la normalización de las técnicas de diagnóstico y el desarrollo de nuevas metodologías de diagnóstico del aborto de origen protozoario en los rumiantes domésticos. Entre las actividades previstas, se ha planteado la realización de estudios comparativos de las técnicas habituales de diagnóstico entre diversos laboratorios de la UE y la elaboración de un manual de referencia, "Guidelines for the Diagnosis of protozoal Abortifacients in Farm Ruminants", donde se recojan las técnicas y criterios a seguir en el diagnóstico de los abortos producidos en los rumiantes domésticos tanto por N. caninum, como por el resto de protozoos -Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., Tritrichomonas foetus- causantes de trastornos reproductivos.

(Si está interesado en las actividades de la Acción COST-854 puede obtener información en luis.ortega@vet.ucm.es)

 

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 Fuente: www.exopol.com

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