 007.
El Uso de Semen Porcino Congelado.
J. Gadea
Departamento Fisiología.
Facultad de Veterinaria.
Universidad de Murcia.
e-mail:
jgadea@um.es,
www.um.es/grupo-fisiovet
Introducción
En la actualidad, la inseminación
artificial porcina es una técnica reproductiva de amplia aplicación en todo el
mundo desarrollado. Sin embargo, el grado de utilización en los diversos países
es muy variable. En los países europeos de nuestro entorno, la aplicación de la
inseminación artificial es muy elevada, superando en muchos países el 80% de las
reproductoras (Holanda, Francia, Alemania, España, Noruega, Finlandia, etc.).
Por el contrario, en los Estados Unidos el porcentaje de utilización de la
inseminación artificial es aún reducido (del orden del 50%), aunque en los
últimos años se ha producido un incremento muy destacable. Según las últimas
estimaciones, la práctica totalidad de las inseminaciones (99%) se realiza con
semen refrigerado a 15–20ºC (Johnson et al., 2000).
El uso de semen congelado queda hoy
día limitado a casos muy específicos, o bien asociado a la introducción en las
explotaciones de nuevo material genético de alto valor para inseminar
determinados animales puros en las granjas de selección, o bien asociados a
labores de investigación. Sin embargo, el uso de semen congelado puede hoy en
día aportar ciertas ventajas sobre el semen refrigerado como son el transporte a
largas distancias o la conservación durante un tiempo muy prolongado (años) con
unos resultados productivos que progresivamente mejoran y se acercan a los
obtenidos con semen refrigerado.
Este artículo tiene como objetivo
revisar, a la luz de las últimas investigaciones, la aplicación que puede tener
en condiciones comerciales el semen congelado, analizando las ventajas y
limitaciones que esta técnica presenta.
Desarrollo histórico
En el año 1949 el equipo del Dr. C.
Polge en Cambridge (Reino Unido) usa por primera vez con éxito el glicerol como
agente crioprotector para congelar espermatozoides. Este hecho supuso un
espectacular desarrollo de los sistemas de congelación de todos los tipos de
células y la paulatina implantación del uso de semen congelado en la
inseminación artificial bovina. Técnicamente la congelación de semen bovino se
ha mantenido básicamente en condiciones muy parecidas a las iniciales hasta
nuestros días y ha sido la base para las grandes mejoras productivas en las
razas lecheras como herramienta fundamental en la difusión genética de los
caracteres productivos.
Por el contrario, en la especie
porcina la aplicación inicial de las técnicas de congelación espermática no se
obtuvo el éxito esperado. Y no es hasta 20 años después, en 1970 también en
Cambridge, cuando obtienen las primeras camadas a partir de semen congelado
mediante la deposición del mismo a nivel uterino mediante una intervención
quirúrgica (laparotomía) (Polge et al., 1970). En estos trabajos está implicado
el mismo Polge, junto a Salomon e Ian Wilmut (que posteriormente se hará
mundialmente famoso como creador de la oveja clónica Dolly). Un año después, en
1971 se obtienen las primeras camadas con inseminación cervical mediante el uso
de catéteres de inseminación en diferentes laboratorios (Crabo y Einarsson,
1971; Pursel y Johnson, 1971; Graham et al., 1971).
Se produce un cambio radical cuando
en el mismo año 1975, en Estados Unidos (Pursel y Johnson, 1975) y en Alemania (Westerndorf
et al., 1975) se desarrollan dos métodos de congelación que pueden ser aplicados
a nivel comercial y que en esencia son los que se continúan utilizando hoy en
día. Ambos métodos utilizan diluyentes que están basados en la utilización de la
yema de huevo y glicerol como agentes crioprotectores, una concentración elevada
de azúcares y la adición de un agente detergente (Orvus et paste).
El método alemán (Westerndorf et
al., 1975) utiliza un medio que consta de lactosa (11%) y yema de huevo (20%) y
envasa las muestras seminales en pajuelas de 5 ml. Mientras que el método
americano Beltsville descrito por Pursel y Johnson (1975) utiliza el medio
denominado BF-5 (Beltsville freezing – 5), en cuya composición se incluye
glucosa, yema de huevo y Tris como agente regulador del pH, y las muestras
seminales se colocan sobre nieve carbónica para congelarse en forma de píldoras
(pellets) de un centenar de microlitros.
El método alemán es el que ha
perdurado con ciertas modificaciones como el uso de pajuelas de menor volumen
(0.5 ml) o ajustes en las condiciones de adición del glicerol (Almid et al.,
1988) y es el más frecuentemente empleado en la actualidad.
Durante la década de los 90 se
mejoraron las condiciones del proceso de congelación con el estudio de nuevos
envases, curvas de congelación, etc. En este periodo la Facultad de Veterinaria
de Upssala en Suecia ha sido un referente mundial, con los trabajos dirigidos
por el profesor Rodríguez-Martínez. En esta misma década se realizaron
importantes estudios sobre las bases de la crioconservación y las
particularidades del proceso en la especie porcina, donde destacan los trabajos
de los británicos PF Watson y WV. Holt.
Ventajas de la inseminación
artificial y del uso del semen congelado
La inseminación artificial como
técnica reproductiva aporta una serie de ventajas, entre las que se encuentran:
La amplia difusión del material
genético del verraco seleccionado que alcanza para inseminar un mayor número de
hembras.
Mejoras sanitarias en la
explotación, al evitar el contacto directo macho-hembras por lo que se impide la
transmisión de enfermedades por vía venérea y por contacto.
Se evalúa continuamente la capacidad
de producir espermatozoides de calidad suficiente para asegurar la fecundación.
Supone de forma indirecta mejorar el
control de los resultados reproductivos de la explotación.
Reducción en el número de verracos
por hembra, con la consiguiente reducción en costes de adquisición, alojamiento,
alimentación, etc. Ese dinero ahorrado puede ser destinado a la compra de
verracos de mejor calidad genética.
Pero la utilización de semen
congelado en el sistema de inseminación puede ofrecer unas ventajas adicionales:
Permite el intercambio de material
genético a larga distancia y durante un periodo muy largo (años). Este periodo
de tiempo puede ser crucial para efectuar un control sanitario o genético del
semen/verraco antes de su uso. Eso es posible hoy con el diagnóstico de
enfermedades infecciosas basado en el estudio de la presencia de ADN del agente
infeccioso mediante técnicas de PCR (Reacción de polimerasa en cadena) y el
desarrollo de marcadores genéticos asociados a la producción es un proceso
creciente.
Creación de bancos genéticos. De
interés evidente en el caso de la conservación de razas en peligro de extinción
(un claro ejemplo es el notable trabajo desarrollado por el Dr. Poto del
Instituto Murciano de Investigación Agroalimentaria en la conservación del Chato
murciano) y de grandes posibilidades para la conservación de líneas o extirpes
de especial interés.
Estos bancos de genes también pueden
ser importantes a nivel comercial por ejemplo para asegurar la conservación de
líneas genéticas valiosas ante posibles situaciones desfavorables (epizootía,
incapacidad para recogida, infertilidad/subfertilidad por altas temperaturas,
etc).
A nivel práctico permite el
introducir material genético de alto valor sin los riesgos derivados de la
introducción de nuevos animales en la explotación. Especialmente aplicable a la
líneas puras (abuelas).
Limitaciones del uso semen de
congelado
El proceso de
congelación/descongelación provoca lesiones en cualquier tipo de célula, pero
los espermatozoides son especialmente sensibles a las bajas temperaturas,
sufriendo el proceso que se denomina “choque por frío”. Las particularidades que
presenta el espermatozoide porcino hace que sea muy sensible al choque por frío
(Pursel et al., 1973), que produce una alteración de funcionalidad de la
membrana espermática y la viabilidad celular se ve comprometida. Estas
alteraciones del espermatozoide suponen que la vida media del mismo se ve
acortada, es decir, se reduce el tiempo en el cual el espermatozoide puede ser
fértil. De tal manera que al usarse en inseminación artificial se obtenían
resultados inferiores a los obtenidos con semen refrigerado como el clásico
trabajo de Johnson et al. de 1985. En él, se concluía que la fertilidad del
semen congelado era sensiblemente menor a la obtenida con semen refrigerado y
que podría estimarse en una reducción media del 20% en la tasa de partos.
La reducción en el rendimiento
reproductivo ha sido el gran limitante de esta técnica. Sin embargo, en los
últimos años se ha realizado un gran esfuerzo para mejorar la fertilidad del
semen congelado en inseminación artificial obteniéndose resultados a nivel
comercial muy prometedores (Thilmant 1998, Gadea et al., 2001; Ericksson et al.,
2002; Ruiz et al., 2002; Sellés et al., 2003) que suponen tasas de partos por
encima del 70% y para algunos machos por encima del 80%. Por tanto, hoy en día
con estos resultados sería conveniente evaluar si es rentable comercialmente el
uso del semen congelado para determinadas aplicaciones, como el uso para las
razas en pureza. En cualquier caso debemos desterrar la idea muy difundida entre
el sector que afirma que los espermatozoides porcinos no se pueden congelar de
forma adecuada y su uso no permite unos rendimientos reproductivos adecuados
porque, sencillamente, no es cierta. Esta misma idea incierta se difunde en
sentido contrario cuando hacemos referencia al semen congelado en el ganado
vacuno de leche, donde la mayor parte de la inseminación artificial se realiza
con semen congelado, cuando la fertilidad obtenida no supera en el mejor de los
casos el 70%.
La utilidad fundamental de esta
técnica está asociada a la incorporación de genética de alto valor a nuestra
explotación (para razas en pureza, abuelas y bisabuelas). Por tanto los
rendimientos reproductivos obtenidos, sin dejar de ser importantes, son
secundarios a la consecución del objetivo primario que es la mejora genética de
nuestra explotación porcina. Desgraciadamente este uso tan claramente rentable
en la actualidad no se está aprovechando quizás debido a un problema en la
transferencia de la tecnología al sector.
Téngase en consideración que si
existiera una red de distribución de semen congelado adecuado, que produjera
dosis seminales congeladas procedentes de animales de valor genético de
excelencia y de calidad seminal suficiente. El ganadero únicamente debería
mantener su dosis en un tanque de nitrógeno líquido (tal como hace el ganadero
de vacuno lechero) y en el momento adecuado descongelar la muestra sobre un
diluyente simple (por ejemplo BTS) y proceder a la inseminación en unas
condiciones similares a las del semen refrigerado. El coste adicional de este
proceso (en ningún caso elevado) sería fácilmente contrarrestado por las mejoras
productivas consecuencia de la introducción en la explotación de material
genético mejorante, y no directamente de la fertilidad obtenida en la
utilización del semen congelado.
En cualquier caso es posible mejorar
los rendimientos reproductivos con semen congelado, permitiendo ampliar su uso a
distintas situaciones donde el rendimiento y ventajas superen a las
limitaciones. Las vías de mejora han ido dirigidas a optimizar los sistemas de
congelación para obtener una calidad seminal aceptable tras la descongelación
(nuevos procedimientos de congelación, diluyentes, aditivos, envases, etc.).
Pero todavía hay algunos aspectos que pueden mejorar sensiblemente.
Amplia variabilidad entre verracos
La selección de verracos ha sido
basada hasta el momento en los rendimientos productivos que éstos ofrecen en la
descendencia (índices de crecimiento y conversión, conformación, calidad de
canal), cubriendo unos mínimos de calidad seminal que aseguren un rendimiento
reproductivo adecuado. Sin embargo, hasta el momento no se ha realizado una
verdadera selección de reproductores por su capacidad de congelación como
previamente se ha realizado en el vacuno de leche.
En numerosos estudios se han
descrito grandes diferencias en la capacidad de congelación que presentan los
espermatozoides de machos diferentes (revisado por Johnson, 1985), que afectan
tanto a la viabilidad de los espermatozoides tras la descongelación como a la
fertilidad in vivo (Johnson et al., 1981). De manera tradicional los machos han
sido clasificados como “buenos congeladores” o “malos congeladores” (Medrano et
al., 2002). Hasta hace muy poco no se sabía nada sobre las posibles causas de
esta variabilidad, de manera que la única solución viable es la de optimizar los
procesos de congelación para reducir al máximo la variabilidad y descartar
aquellos machos realmente malos congeladores (Gadea y cols, 2003). Recientemente
se han encontrado los principios de una base genética que justifique estas
diferencias (Thurston et al., 2002). Un apasionante nuevo campo de estudio se
abre para los próximos años, cuando sea posible detectar mediante el uso de un
marcador genético aquellos verracos con mayor capacidad de congelación
espermática.
Coste de las dosis seminales
congeladas
Uno de los problemas a solucionar es
el mayor coste que presentan las muestras seminales congeladas. Esto es debido a
diversas causas:
El número de espermatozoides por
dosis es sensiblemente mayor en el caso de semen congelado frente al refrigerado
para asegurar unos buenos resultados reproductivos. Se usan dosis de 5-6 x 109
espermatozoides cuando en refrigerado es de 2-3 x 109. De esta manera, de un
eyaculado sólo podemos producir la mitad de dosis que en el uso común.
La producción de las dosis es más
costosa en tiempo y materiales. Además requiere un equipamiento sofisticado y
costoso que sólo es rentable si la producción de dosis congeladas es elevada.
El mantenimiento de las dosis en
tanques de nitrógeno líquido de las muestras seminales es costoso ya que se
necesitan varias pajuelas por inseminación, de manera que el consumo de
nitrógeno líquido es importante.
En la actualidad, se está haciendo
un esfuerzo en reducir el número de espermatozoides por dosis, que así mismo
supondría reducir significativamente el coste de producción y mantenimiento,
para ello hay abiertas diversas líneas de actuación:
Mejorar los procesos de congelación,
para que haya una proporción mayor de espermatozoides viables en el momento de
la inseminación.
Sincronizar mejor el momento de la
ovulación de la cerda con el momento de inseminación de tal manera que
aseguremos el encuentro del mayor número de espermatozoides viables con los
ovocitos recién ovulados (Larson, 1976). Esto implica, o bien, el empleo de
diagnósticos de ovulación mediante el uso de ecografía por vía rectal o
transabdominal (Knox y Zas, 2001), o bien, la utilización de protocolos de
sincronización de la ovulación con tratamientos hormonales (de Rensis et al.,
2003).
Utilización de inseminaciones
intrauterinas profundas que permitan reducir el número de espermatozoides por
dosis (Roca et al., 2003).
Por nuestra parte, el equipo de
investigación Fisiología de la Reproducción de la Universidad de Murcia comenzó
a trabajar en congelación de espermatozoides porcinos en el año 1996, gracias a
la financiación obtenida en la Comisión Interministerial de Ciencia y
Tecnología. En los inicios el objetivo fue la puesta a punto de los sistemas de
congelación con una tecnología muy rudimentaria y la aplicación a la
conservación de material genético de alto valor tanto de razas en peligro de
extinción como el Chato Murciano (Peinado et al., 1998) y animales de razas
comerciales. En esa primera etapa, se pusieron a punto los protocolos de
congelación, se experimentó con los diversos envases disponibles y se utilizaron
nuevas técnicas para evaluar la calidad del semen después de la descongelación.
Igualmente se puso a punto la
técnica de fecundación in vitro con espermatozoides congelados (Gadea et al.,
1998ª y 1998b; Matás et al., 2002), que por una parte permite producir embriones
in vitro que tras la correspondiente transferencia permita el nacimiento de
lechones (Coy et al., 2001). Por otra parte la fecundación in vitro es el
sistema más preciso para evaluar la capacidad fertilizante del semen congelado
(Selles et al., 2003).
Se han estudiado diversos factores
que pueden mejorar la eficiencia de la técnica: la curva de congelación con
sistemas automatizados o biocongeladores (Murgas et al., 2001; Ruiz et al.,
2002), las condiciones optimas para la descongelación (Sellés et al., 2003), las
diferencias en la capacidad de congelación de las diversas fracciones del
eyaculado (Sellés et al., 2001), las condiciones en las que se produce la
inseminación (Ruiz et al., 2003), así como el efecto de la estación, la línea
genética y el verraco en la capacidad de congelación (Gadea et al., 2003). Los
resultados de fertilidad del semen congelado a nivel comercial parecen muy
prometedores obteniendo tasas de partos superiores al 70% ya alcanzando para
algunos verracos más del 80% (Gadea et al., 2001; Ruiz et al., 2002 y 2003;
Selles et al., 2003).
En los últimos tiempos nos hemos
centrado en el estudio de las alteraciones que produce la congelación en la
célula espermática y, especialmente, en la desestabilización que se produce
durante la congelación del sistema antioxidante del espermatozoide. Esta
información sobre los procesos básicos puede se vital para posteriormente
aplicarla en el diseño de nuevos protocolos y diluyentes que permitan minimizar
el daño espermático. El contenido de glutatión (principal agente antioxidante no
enzimático) se reduce durante el proceso de congelación (Gadea et al., 2004),
así como se alteran las proteínas de la membrana espermática (Gadea et al.,
2004). La adición de este glutatión en los diluyentes hasta el momento no tiene
un efecto claro, la aplicación en el medio de congelación no parece tener un
efecto positivo (Sellés et al., 2003; Matás et al., 2004). Sin embargo, si hay
una mejora al añadir este compuesto en el medio de descongelación (Gadea et al.,
2000 y 2004). Igualmente estamos estudiando como se modifican las proteínas de
la membrana de los espermatozoides por el proceso de congelación (Marco y gadea,
2003; Gadea et al., 2004b) información que nos permitirá evaluar si los nuevos
procesos son más eficientes.
Esperamos poder seguir avanzando en
el conocimiento en este campo para poder transferir los resultados de nuestra
investigación al sector productivo.
Conclusiones
El uso del semen congelado en la
especie porcina no ha sido muy difundido hasta el momento. Esta técnica aporta
unas ventajas muy interesantes para el sector y se dispone de la suficiente
experiencia sobre el tema para poderla aplicar de forma satisfactoria en unas
determinadas situaciones en condiciones de campo. Al mismo tiempo las
investigaciones sobre este campo apuntan a una mejora notable en los resultados
reproductivos que permitirán un uso más amplio en un futuro próximo
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1. Dilucion en BTS 1:1
2. Mantener en refrigerador a 15ºC durante 2.5 horas
3. Centrifugacion a 1000g x 10 min
4. Resuspender en 11% lactosa + 20 % yema de huevo
(diluyente A)
5. Ajustar concentración a 109 spz/ml
6. Mantener a 5ºC durante 2 horas
7. Mezclar dos parte diluyente A+ una parte diluyente B
(1,5 %l Equex + 6-9% glicerol)
8. Vapores de nitrógeno durante 20 min o Biocongelador
9. Sumergir en nitrógeno y conservar en tanque
Este artículo ha sido publicado en Mundo ganadero. 169: 60-62. 2004 Gadea
J.
El uso de semen porcino
congelado
Joaquín Gadea
DVM, PhD, Dipl. ECAR
Associate Professor
Dept. Physiology
Facultad de Veterinaria - Universidad de Murcia
30.100 Murcia (España - Spain)
Tn:34-968-364655 Fax:34-968-364147
e-mail:jgadea@um.es
http://www.um.es/grupo-fisiovet/
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