 026.
Utilidad de técnicas directas e indirectas en el diagnóstico de
trichinellosis en el cerdo.
Dra. en C. María.
Alejandra Moreno García*, M. en C. José Jesús Muñoz Escobedo **, M. en C. Rosa
Gabriela Reveles Hernández *, M.V.Z. Sergio Saldivar Elías* y Dra. en C. María
Del Refugio Vació De La Torre.*
* Departamento de
Biología Celular y Microbiología Unidad Académica de Biología Experimental,
Universidad Autónoma de Zacatecas. Colonia Tierra y Libertad S/n Guadalupe,
Zacatecas México.
** Unidad Académica
de Odontología, Universidad Autónoma de Zacatecas.
Guadalupe,
Zacatecas México.
RESUMEN
La Trichinellosis porcina constituye un problema de
salud pública, ya que el cerdo es el principal transmisor al humano causándole
ya sea la enfermedad y muerte o bien deteriora su calidad de vida. En México, la
mayoría de las infecciones en humanos ocurre por ingesta de carne de puerco
contaminada con T. spiralis.
En nuestro país la investigación epidemiológica
relacionada con la Trichinellosis, indica que esta enfermedad tiene una
frecuencia hasta de 8.1% de la población general, por lo que se considera un
problema de salud pública.
Se ha logrado un gran avance en el diagnóstico
con la aplicación de estudios serológicos para detectar anticuerpos anti T.
spiralis. Estas pruebas comprenden: IDD, Dot ELISA e IET
El presente estudio tuvo la finalidad de analizar
carne y sueros de cerdos por técnicas directas e indirectas respectivamente a
una población de 300 cerdos.
Se analizaron un
total de 300 muestras: 200 sueros de cerdos vivos [100 de granjas tecnificadas y
100 de cerdos de traspatio] de los diferentes municipios del Estado de
Zacatecas, se les realizó técnica indirecta de IDD, Dot-ELISA e IET, 100 más
fueron de cerdos sacrificados del rastro las ciudades de Jerez y Zacatecas
analizándolos por técnicas directas de compresión y digestión artificial y
técnicas indirectas las ya mencionadas. De los tejidos
analizados por compresión únicamente se encontró uno con 1.5 LI por campo, por
la técnica de digestión artificial también fue positivo con 45 larvas en 25
mL,
por la técnica de IDD el resultado fue negativo al 100 %. Al aplicar las
técnicas Dot ELISA e IET arrojan ambas un valor de16 sueros positivos, el 5.33
%.
PALABRAS
CLAVE: Técnicas directas e indirectas, diagnostico, Trichinellosis, cerdo.
SUMARY
Swinsh Trichinellosis constitutes a public health
problem, since the pig is the main transmitter to humans causing the sickness
and death or deteriorating their quality of life. In Mexico, most infections in
humans occur through the consumption of contaminated pork meat with T.
spiralis.
In our country the epidemic investigation related with
Trichinellosis, indicates that this sickness has a frequency of up to 8.1 % of
the general population, thus being considered as a public health problem.
A great advance has been achieved in the diagnostic with the
use of directs and indirect techniques to detect anti –T. spiralis
antibodies. This test include: IDD, Dot ELISA, ELISA and IET.
The present study had as its final objective the
diagnostic of Trichinellosis in swine.
A total of 300 samples were analyzed, IDD, Dot -ELISA,
and IET techniques were applied to serums, and the meat treated with compression
and artificial digestion.
From the tissues analyzed by compression only was found
to have 1.5 larvae per field, for the artificial digestion technique was found
to have 45 larvae per 25 mL
and for the IDD 100 % was negative. When the Dot –ELISA and IET techniques were
carried out a positive value of 5.33 % was obtained (16 serums)
KEY WORDS: Direct and indirect techniques,
diagnostic, Trichinellosis, swine.
INTRODUCCIÓN
El genero consta de siete especies
conocidas como T. nativa, T. nelsoni, T.
spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi. T . murrelli y T. papuae así como tres fenotipos conocidos como
T6, T8 y T9 que permanecen sin nombrar aun (1).
La
morfología de T. spiralis pertenece a los helmintos (gusano redondo) en
estado adulto las hembras son más grandes que los machos midiendo 3 mm de
longitud por 0.06 mm de grosor, mientras que el macho mide 1.5 mm por 0.04 mm.
Se consideran vivíparos, sus productos (larvas recién nacidas) llegan a medir
0.08 mm por 9 micras de grosor. Los machos son más delgados en la parte
anterior que en el extremo posterior (2).
El ciclo de
vida de T. spiralis, se puede encontrar en un huésped intermedio
y un huésped definitivo. Para la infección del hombre, el huésped definitivo que
transmite al parásito, es el cerdo en América y España, en Francia e Italia por
el caballo y en Asia por el perro. En el caso de la infección del cerdo o del
caballo, el huésped intermedio es la rata la cual se cree se infecta por consumo
de desperdicios de vísceras en los rastros o por canibalismo (3)(4)., Así mismo
dependiendo de la especie y el fenotipo es el huésped y la región geográfica.
La
Trichinellosis se confunde con muchos síndromes clínicos y como consecuencia es
frecuentemente mal diagnosticada, algunos médicos dividen a la Trichinellosis
clásica en la fase temprana o entérica, la fase muscular y la fase
convaleciente, la fase entérica se suele confundir con una infección bacteriana
y la fase muscular, con artritis reumatoide (5).
La Trichinellosis porcina constituye un problema de salud
pública, ya que el cerdo es el principal transmisor al humano causándole la
enfermedad y muerte o bien le deteriora su calidad de vida. En México, la
mayoría de las infecciones en humanos ocurre por la ingesta de carne de puerco
contaminada con T. spiralis (6)(7)(8).
Cuando el hombre ingiere carne de cerdo cruda o
mal cocida, que contiene larvas infectivas, en su intestino se lleva a cabo la
madurez y los parásitos adultos se aparean. Después del quinto día, las larvas
recién nacidas se transportan a los tejidos con un tropismo específico por el
músculo estriado. Durante estos eventos se desencadena la respuesta inmune de
tipo humoral y celular. La respuesta inmune humoral se refiere a la producción
simultánea de grandes cantidades de IgE y de anticuerpos (Ac) de otras clases,
que son características inmunológicas notables de la infección por helmintos. El
efecto de potencialización se ejerce sobre una gran variedad de antígenos, los
anticuerpos IgE específicos sólo representan del 5 al 6% de la IgE total. La
producción de anticuerpos específicos se puede determinar por pruebas
Inmunológicas o por intradermoreacción. En el humano, la infección provoca
inicialmente, la síntesis de anticuerpos de clase IgM seguida de la respuesta de
IgG, y se han demostrado anticuerpos de clase IgA, estimulada por las larvas a
su paso por el intestino (9).
Comparaciones entre los métodos de digestión
artificial y trichinoscopía en carne de cerdo demuestran que existen
diferencias significativas (p>0.01)
entre ambos, esto con dosis bajas de infección, sin embargo con animales
inoculados con 5X10 3 y 5X 104 larvas no se encontraron
diferencias significativas (p>0.05)(10).
Se ha logrado un gran avance en el diagnóstico con la
aplicación de estudios serológicos para detectar anticuerpos anti-T. spiralis.
Estas pruebas comprenden las pruebas de precipitación en gel (11),
inmunoenzimáticas como el ensayo inmuno absorbente con enzima unida (ELISA), el
ensayo inmuno absorbente con enzima unida en papel de nitrocelulosa (Dot
–ELISA) (12) practicadas tanto en sueros de cerdos como de humanos, logrando una
especificidad y sensibilidad por arriba del 90%, utilizando como antígeno el
antígeno soluble total (AST) o un extracto de proteínas de secreción excreción
(ES) de las larvas infectivas (LI) de T. spiralis, otro método aplicable
es la Inmunoelectrotransferencia (IET), por medio del cual en humanos se han
detectado patrones polipeptídicos entre 38 y 104 kDa que son comunes en el
diagnóstico de la Trichinellosis porcina (13).
En México la investigación
epidemiológica relacionada con la Trichinellosis, indica que esta enfermedad
tiene una frecuencia hasta de 8.1% de la población general, por lo que se
considera un problema de salud pública (14).
Entre 1978 y 1983 en el estado de
Zacatecas se dieron 17 brotes con 108 casos humanos, lo anterior reportado por
la Organización Panamericana de la Salud. El primer brote en Zacatecas fue
registrado en 1976 en Laguna del Carretero municipio de Villanueva con 8
defunciones, y entre 1982 y 1983 Del Río y Col. Encontraron 8 diafragmas
positivos en 51 cadáveres analizados (15).
La implementación de técnicas directas e indirectas
inmunológicas ha resultado favorable para la detección de T. spiralis en
los modelos experimentales rata, ratón y conejo por lo que la utilización de
éstas en el diagnóstico en cerdos vivos y de rastro en la infección natural, es
también factible.
OBJETIVO
Detectar la presencia de T.
spiralis por métodos directos e indirectos a una población de 300 cerdos.
Objetivos particulares.
Utilizar el modelo experimental porcino raza York
para el diagnóstico de T. spiralis, utilizando técnicas directas e
indirectas.
Comparar los resultados obtenidos por las diferentes técnicas
(directas e indirectas) en el modelo experimental y los cerdos de estudio.
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención del antígeno soluble total de
Trichinella spiralis.
La obtención se llevó a cabo de dos maneras; por
sonicación de un preparado de las larvas en solución pepsina 10,000U –HCl 0.2M
(16) y por su extracción mediante Nitrógeno líquido (17) de la cepa que se ha
venido conservando en el bioterio de la Unidad Académica de Biología
Experimental de la UAZ.
MODELO EXPERIMENTAL
El modelo experimental que fue usado en este estudio
consistió de 3 cerdos hembras raza York de 12 meses de edad, divididas
en dos lotes: 2 cerdos infectados con T . spiralis 1 larva infectiva por
gramo de peso cada uno, el otro lote consistió en 1 cerdo sin infectar
para ser usado como testigo negativo, sangrándolos a todos semanalmente por
12 semanas, los sueros así obtenidos se utilizaron para probar la reactividad
antigénica del AST, así como para probar la eficacia diagnóstica de las
diferentes pruebas indirectas ( IDD, Dot-Elisa y IET) de interés en este
estudio.
Una vez transcurridos las 12 semanas, los animales fueron
sacrificados implementándoles la técnica de compresión en placa de los tejidos:
diafragma, lengua, masetero y pierna, 30 gramos de carne se sometieron a
digestión artificial y un fragmento de .5 cm de los tejidos mencionados fue
fijado en formol para su procesamiento en la técnica de Hematoxilina-Eosina.
Desarrollo de la compresión del tejido
Para el desarrollo de la técnica de compresión en placa
se necesitaron aproximadamente 0.05 g de carne de cada porción de los cerdos
de estudio, a cada muestra se le colocó sobre una laminilla se comprimió con
otra, ocupando una área de 1 X 5 mm. y se observó al microscopio con el lente
10X realizándose el conteo por campo, el testigo fue tratado de igual manera.
Digestión artificial
Se les
realizó también a la carne, éste se llevo a cabo a 37º C por 24 horas según
el método descrito por Del Río y col. con algunas modificaciones (16). 30 g de
carne fue colocada en un tamiz de tul en forma de saco, se suspendió en una
solución al 3 % de pepsina (10,000 U) y de HCl al 37 % [0.2M] en agua destilada
en un embudo de separación, transcurridas las 24 horas se procedió a separar las
larvas que se depositaron en el fondo del embudo, se recolectaron y se procedió
a su visualización al microscopio con el lente 10 X.
Tinción
con Hematoxilina - Eosina
El tejido fue fijado en formol al 10% para cortes
histológicos con el fin de determinar las características por tinción de
Hematoxilina _Eosina de la célula Nodriza. Los tejidos se
deshidrataron para luego procesarlos en parafina. Esto fue llevado a cabo en el
aparato procesador de tejido ( Lipshaw Automatic Tissue Processor) de acuerdo a
los siguientes pasos:
Formol al 10 % por 12 horas alcohol etílico al 80% por 1
hora alcohol etílico del 96% 3 cambios cada uno de 30 min. , Alcohol etílico
absoluto 3 cambios de 1. 5 horas cada uno, Xileno 2 cambios de 1.5 horas y por
último parafina a 60 °C , 2 cambios de 1.5 horas, se colocaron los tejidos en
moldes cúbicos con ésta hasta enfriar.
Luego de 24 horas se colocan en cama de hielo para efectuar
los cortes, teniendo cada uno un grosor de 4m
en el Microtómo modelo 820 rotary, American Optical. Posteriormente se colocó
en un portaobjetos cubriéndolos luego con un gel hecho a base de clara de huevo
y glicerol (1:1) más unos granos de tibol como conservador. Los cortes así
tratados se colocaron en placa caliente para fundir la parafina y continuar con
la tinción con Hematoxilina – Eosina, tal como lo describe el libro de las
Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Norteamérica (17).
El proceso de tinción se llevó a cabo en un tren de tinción:
los portaobjetos se colocaron en una canastilla misma que fué introducida en las
siguientes soluciones; : Xileno 5min., xileno 5 min., alcohol etílico absoluto 3
min., Alcohol etílico al 96% 3 min., alcohol etílico al 96% 3 min., agua
potable y agua destilada (de manera rápida), Hematoxilina de Harris ( por unos
segundos) agua potable, alcohol ácido al 1 % (de manera rápida) agua potable,
solución saturada de carbonato de litio 2 min. , agua potable-Eosina (por unos
segundos) agua potable dos cambios en alcohol etílico al 96 %, 3 cambios en
alcohol etílico absoluto, Xileno (todos los pasos anteriores son de 1min.) se
mantuvieron las laminillas mientras se fueron montando con resina sintética
Sigma â
y se cubrieron con cubreobjetos quedando listas para su observación al
microscopio óptico.
MODELO DE ESTUDIO
300 muestras: 200 sueros de cerdos vivos [100 provenientes
de traspatio y 100 más del tipo de explotación tecnificada] de diferentes
comunidades del estado de Zacatecas y 100 sueros y diafragmas de cerdos
provenientes del rastro municipal de las ciudades de Zacatecas y Jerez Zac.
A los diafragmas se les practicaron las técnicas de
compresión y digestión artificial y a los sueros se les practicó la IDD, Dot –
ELISA e IET, la tinción con Hematoxilina – Eosina, se usó únicamente con los
animales de experimentación.
Desarrollo de la técnica de IDD
Se elaboró un gel de agar al 1 % en agua con azida de
sodio para evitar contaminación, se colocó en una cantidad de 4.5 mL a 55° C
sobre una laminilla de vidrio, una vez en forma sólida se procedió a formar la
roseta con un horadador procurando una equidistancia de 0.5 cm entre pozo y
pozo, la confrontación se hizo colocando siempre el antígeno en una cantidad de
20 mL
(18 mg)
en el centro y en torno a este un suero de reactividad conocida en la misma
proporción en volumen sin diluir, dejando en cámara húmeda de 24 a 48 horas
hasta observar líneas de precipitación entre el suero positivo y el antígeno,
luego se procedió a teñir el gel con azul brillante de Coomassie G 250 en un
25 % en volumen (18).
Realización de la técnica de Dot - ELISA
El papel de nitrocelulosa se cuadriculo de 1 cm2
ocupando un total de 10 cm2 para cada prueba con el fin de que
fueran analizados cada vez 100 sueros. Se pegó el antígeno al papel colocando 1
mL
en cada cuadro lo que equivale a 0.9mg,
se dejó toda la noche a temperatura ambiente, bloqueando con leche libre de
grasa al 3% al día siguiente por 1 hr. , lavando por una ocasión con PBS –Tween
20 al 0.5 % con agitación por 10 min., se colocaron los sueros problema en una
cantidad de 1 mL
por cuadro en una dilución, de 1: 100, dejando incubar por 1 hora, lavando
nuevamente con PBS –Tween 20 al 0.5 % por 10 min., y se luego colocó el segundo
anticuerpo Anti- IgG de cerdo conjugado a peroxidasa en dil.1: 2000 en PBS
incubando por 1 hora, lavando con PBS –Tween 20 al 0.5 % por 10 min. por 2
ocasiones por 10 min. , se enjuagó con PBS por 10 min. se reveló con 3-3´
di-amino Benzidina usando peroxido de hidrógeno al 37 % como sustrato (12).
Implementación de la técnica de
IET
El producto obtenido del corrimiento en gel de
poliacrilamida se transfirió a papel de NC de acuerdo a lo descrito por Towbin
(19).Utilizando la cámara de Transblot- Cell ( Bio – Rad.)Ò
a 35 voltios, durante toda la noche a 4 ° C.
El papel de NC fue teñido con fast green (verde rápido) por 5
min. con agitación constante, se retiró el colorante y fue decolorado en agua
destilada, para verificar transferencia de las proteínas, se dejó secar y se
cortaron las tiras del ancho aproximado de cada carril ( 0.5 cm).
transcurrido lo anterior se procedió a cubrir cada tira con
una solución de PBS- leche en polvo al 3% y azida de sodio al 0.15 a 4 °C, con
agitación constante por toda la noche. en seguida se lavaron 3 veces por 10 min
con PBS, se continuó con la incubación por 1.5 hr. con los sueros de los cerdos
en una dilución de 1:100 en PBS- leche en polvo al 3% a 37 °C con agitación
constante, se lavaron enseguida por dos ocasiones con PBS- Tween 20 al 0.3% por
10 min. y tres más con PBS por 10 min. A continuación se incubó con el segundo
anticuerpo Anti- Ig G de cerdo conjugado con peroxidasa 1: 2000 PBS- leche en
polvo al 3% por 1 hr, a temperatura ambiente con agitación, después se lavaron 2
veces con PBS- Tween 20 al 3% y se enjuagaron con PBS por tres ocasiones por
10 min. cada una.
El patrón de Bandeo de cada tira se reveló con 3,3´ di-amino
– benzidina (DAB), 50 mg en 100 mL de PBS , usando como sustrato peroxido de
hidrógeno al 37 % (12).
RESULTADOS
Caracterización del antígeno
La concentración proteica del antígeno fue de 90
mg / mL
.
Su corrimiento en geles de poliacrilamida mostró un bandeo
comprendido entre 24 - 97 kDa predominando el triplete de 43,45 y 48 kDa.
Característico de T. spiralis
Técnicas directas e indirectas
en el modelo experimental
Por la técnica de digestión artificial se encontraron 100
larvas en 25 mL
del producto.
En cuanto a la técnica de compresión del tejido se
encontraron un total de10 LI por campo.
En la tinción con Hematoxilina
–Eosina se encontró el mismo patrón de célula Nodriza ya bien caracterizado.
Se encontró una positividad en IDD hasta la cuarta semana,
por Dot -ELISA a la tercera semana mostró positividad, por el método de IET a
la segunda semana se encontraron resultados positivos reconociendo el triplete
característico de 43, 45 y 48 kDa.
Técnicas directas e indirectas a
los animales de estudio
De los
tejidos analizados de los cerdos del rastro, el resultado obtenido por la
técnica de compresión de tejido en placa fue de un diafragma positivo con 1.5
larvas por campo (Foto 1), representando el 0 .3 % de positividad.
Por la
técnica de digestión artificial se halló un tejido positivo con 45 larvas en 25
mL
del digerido, siendo el mismo de la técnica anterior.
Por el
método de IDD realizado se encontró que el 100% fue negativo, para el total de
los 300 sueros.
Al realizar
la técnica de Dot –ELISA a los sueros del rastro, se obtuvo un valor del 6.00 %
de positividad (6 sueros) (Foto2).
Los
resultados obtenidos en los sueros de los cerdos de los dos tipos de explotación
; traspatio y tecnificada, fueron 5 y 5 positivos respectivamente (Foto 3 y 4).
Mediante la
utilización de la metodología de IET para la detección de T. spiralis en
los sueros de los cerdos, se encontraron un total de 16 positivos (Foto5 y 6)
con el predominio del triplete de 42,45 y 48 kDa, los mismos hallados por Dot-ELISA,
en el total de los 300 sueros.
DISCUSIÓN
Al
implementar las técnicas directas e indirectas en animales infectados
experimentalmente encontramos resultados positivos. Al llevarlas a cabo con
animales silvestres, el desarrollo de la técnica de IDD ha dado negatividad al
100% lo cual indica que para sueros con niveles de anticuerpos bajos, baja
carga parasitaria <
1.5 LI por campo y con poco tiempo de infección esta técnica no resulta
adecuada.
Al detectar anticuerpos anti T. spiralis por las
técnicas de Dot-ELISA y por IET en un numero de 16 en sueros reportados como
negativos por IDD, digestión y compresión en placa, concluimos que la técnica
de Dot-ELISA puede ser usada para grandes tamices de diagnóstico para
Trichinellosis porcina, la técnica de IET es adecuada cuando de especificidad
se trata como método diagnóstico en Trichinellosis.
El presente estudio reporta la importancia de las técnicas
indirectas de especificidad y de alta sensibilidad en sueros de cerdos vivos, ya
que al llevar a cabo el diagnostico previo al sacrificio permitiría evitar el
consumo de carne contaminada por el hombre, desafortunadamente T. spiralis sigue presente como una zoonosis endémica en Zacatecas México que es
diagnosticada solo en brotes epidémicos.
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Fig. No.1. Compresión del tejido de cerdo del rastro
municipal de Jerez; Al microscopio óptico aumento 40X.
Fig.2. Técnica de Dot. ELISA aplicada a sueros de cerdos de
rastro, los puntos obscuros son los sueros positivos(6+).
3controles positivos.
Fig. 3. Dot
ELISA aplicada a cerdos de traspatio, los puntos obscuros son los positivos
(5+).
3 positivos control 3 negativos control
Fig. 4. Dot
ELISA aplicada a los sueros de cerdos con explotación tecnificada; los puntos
obscuros son los positivos (5+)
Fig.
No.5. IET Aplicada a sueros de cerdos de rastro; carril A Pesos
Moleculares, B Antígeno Soluble Total, C sueros de* Cerdos de
rastro con el predominio del triplete característico de 42-45 y 48 Kda..
TT
Fig. No.6. IET, A: sueros positivos de cerdos de los dos tipos de explotación.
Tecnificada y traspatio B: 2 sueros positivos control y C 3 sueros
negativos control. En los positivos el *El triplete característico de 42,45 y
48 kDa.
Fuente: www.vet-uy.com
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