 028. Utilización de
Técnicas directas e indirectas en el diagnóstico de Trichinellosis en
cerdo.
Dra.
en C. María. Alejandra Moreno García*, M. en C. José Jesús Muñoz Escobedo **,
M. en C. Rosa Gabriela Reveles Hernández *, M.V.Z. Sergio Saldivar Elías* y
Dra. en C. María Del Refugio Vació De La Torre.*
*
Departamento de Biología Celular y Microbiología Unidad Académica de Biología
Experimental, Universidad Autónoma de Zacatecas. Colonia Tierra y Libertad s/n
Guadalupe, Zacatecas México.
**
Unidad Académica de Odontología, Universidad Autónoma de Zacatecas.
Guadalupe, Zacatecas México.
Email:
amoreno_29@hotmail.com
RESUMEN
La Trichinellosis es una
enfermedad parasitaria el cerdo es el principal transmisor al humano
causándole ya sea la enfermedad y muerte o bien deteriora su calidad de vida.
En México, la mayoría de las infecciones en humanos ocurre por ingesta de carne
de puerco contaminada con T. spiralis.
En nuestro país la investigación
epidemiológica relacionada con la Trichinellosis, indica que esta enfermedad
tiene una frecuencia hasta de 8.1% de la población general, por lo que se
considera un problema de salud pública.
Se ha logrado un
gran avance en el diagnóstico con la aplicación de estudios serológicos para
detectar anticuerpos anti T. spiralis. Estas pruebas comprenden: IDD, Dot
ELISA e IET
El presente estudio tuvo la
finalidad de analizar carne y sueros de cerdos por técnicas directas e
indirectas respectivamente a una población de 300 cerdos.
Se analizaron un
total de 300 muestras: 200 sueros de cerdos vivos [100 de granjas tecnificadas y
100 de cerdos de traspatio] de los diferentes municipios del Estado de
Zacatecas, se les realizó técnica indirecta de IDD, Dot-ELISA e IET, 100 más
fueron de cerdos sacrificados del rastro las ciudades de Jerez y Zacatecas
analizándolos por técnicas directas de compresión y digestión artificial y
técnicas indirectas las ya mencionadas. De los tejidos
analizados por compresión únicamente se encontró uno con 1.5 LI por campo, por
la técnica de digestión artificial también fue positivo con 10
mL de
LI, por la técnica de IDD el resultado fue negativo al 100 %. Al aplicar las
técnicas Dot ELISA e IET arrojan ambas un valor de16 sueros positivos, el 5.33
%.
PALABRAS
CLAVE: Diagnóstico, Trichinellosis, cerdo.
Use of Direct and Indirect
techniques in the Diagnostic of Trichinellosis in pig.
SUMARY
Swinsh Trichinellosis constitutes
a public health problem, since the pig is the main transmitter to humans causing
the sickness and death or deteriorating their quality of life. In Mexico, most
infections in humans occur through the consumption of contaminated pork meat
with T. spiralis.
In our country the epidemic
investigation related with Trichinellosis, indicates that this sickness has a
frequency of up to 8.1 % of the general population, thus being considered as a
public health problem.
A great advance has been achieved
in the diagnostic with the use of directs and indirect techniques to detect anti
–T. spiralis antibodies. This test include: IDD, Dot ELISA, ELISA and
IET.
The present study had as its final
objective the diagnostic of Trichinellosis in swine.
A total of 300 samples were
analyzed, IDD, Dot -ELISA, and IET techniques were applied to serums, and the
meat treated with compression and artificial digestion.
From the tissues analyzed by
compression only was found to have 1.5 larvae per field, for the artificial
digestion technique was found to have 10 mL
de LI and for the IDD 100 % was negative. When the Dot –ELISA and IET techniques
were carried out a positive value of 5.33 % was obtained (16 serums)
KEY WORDS: Diagnostic,
Trichinellosis, pig.
INTRODUCCIÓN
El genero consta de
siete especies conocidas como T. nativa, T. nelsoni,
T. spiralis, T. pseudospiralis, T. britovi.
T . murrelli y T. papuae así como tres fenotipos
conocidos como T6, T8 y T9 que permanecen sin nombrar aún (1).
La
morfología de T. spiralis pertenece a los helmintos (gusano redondo) en
estado adulto las hembras son más grandes que los machos midiendo 3 mm. de
longitud por 0.06 mm. de grosor, mientras que el macho mide 1.5 mm. por 0.04 mm.
Se consideran vivíparos, sus productos (larvas recién nacidas) llegan a medir
0.08 mm. . Los machos son más delgados en la parte anterior que en el extremo
posterior (2) (fotografía 1).
Fotografía 1.- En la Parte
superior una hembra y en la inferior el macho (Laboratorio de Biología Celular y
Microbiología UABE.UAZ (16)).
El ciclo
de vida de T. spiralis, se puede encontrar en un huésped
intermedio y un huésped definitivo. Para la infección del hombre, el huésped
definitivo que transmite al parásito, es el cerdo en América y España, en
Francia e Italia por el caballo y en Asia por el perro. En el caso de la
infección del cerdo o del caballo, el huésped intermedio es la rata la cual se
cree se infecta por consumo de desperdicios de vísceras en los rastros o por
canibalismo (2,3,4)., Así mismo dependiendo de la especie y el fenotipo es el
huésped y la región geográfica (Fotografía 2).
Fotografía 2.- Ciclo Vital de
Trichinella spiralis (4).
La
Trichinellosis se confunde con muchos síndromes clínicos y como consecuencia es
frecuentemente mal diagnosticada, algunos médicos dividen a la Trichinellosis
clásica en la fase temprana o entérica, la fase muscular y la fase
convaleciente, la fase entérica se suele confundir con una infección bacteriana
y la fase muscular, con artritis reumatoide (5).
La Trichinellosis porcina
constituye un problema de salud pública, ya que el cerdo es el principal
transmisor al humano causándole la enfermedad y muerte o bien le deteriora su
calidad de vida. En México, la mayoría de las infecciones en humanos ocurre por
la ingesta de carne de puerco contaminada con T. spiralis (6)(7)(8).
Cuando el hombre
ingiere carne de cerdo cruda o mal cocida, que contiene larvas infectivas, en su
intestino se lleva a cabo la madurez y los parásitos adultos se aparean. Después
del quinto día, las larvas recién nacidas se transportan a los tejidos con un
tropismo específico por el músculo estriado. Durante estos eventos se
desencadena la respuesta inmune de tipo humoral y celular. La respuesta inmune
humoral se refiere a la producción simultánea de grandes cantidades de IgE y de
anticuerpos (Ac) de otras clases, que son características inmunológicas
notables de la infección por helmintos. El efecto de potencialización se ejerce
sobre una gran variedad de antígenos, los anticuerpos IgE específicos sólo
representan del 5 al 6% de la IgE total. La producción de anticuerpos
específicos se puede determinar por pruebas Inmunológicas o por
intradermoreacción. En el humano, la infección provoca inicialmente, la síntesis
de anticuerpos de clase IgM seguida de la respuesta de IgG, y se han demostrado
anticuerpos de clase IgA, estimulada por las larvas a su paso por el intestino
(9).
Comparaciones entre los métodos
de digestión artificial y compresión en placa en carne de cerdo demuestran que
existen diferencias significativas (p>0.01)
entre ambos, esto con dosis bajas de infección, sin embargo con animales
inoculados con 5X10 3 y 5X 104 larvas no se encontraron
diferencias significativas (p>0.05)(10).
Se ha logrado un gran avance en
el diagnóstico con la aplicación de estudios serológicos para detectar
anticuerpos anti-T. spiralis. Estas pruebas comprenden las pruebas de
precipitación en gel (11), inmunoenzimáticas como el ensayo inmuno absorbente
con enzima unida (ELISA), el ensayo inmuno absorbente con enzima unida en papel
de nitrocelulosa (Dot –ELISA) (12) practicadas tanto en sueros de cerdos como de
humanos, logrando una especificidad y sensibilidad por arriba del 90%,
utilizando como antígeno el antígeno soluble total (AST) o un extracto de
proteínas de secreción excreción (ES) de las larvas infectivas (LI) de T.
spiralis, otro método aplicable es la Inmunoelectrotransferencia (IET), por
medio del cual en humanos se han detectado patrones polipeptídicos entre 38 y
104 kDa que son comunes en el diagnóstico de la Trichinellosis porcina (13).
En
México en el 2002 se detecto en 22 estados de la Republica Mexicana (14).
Entre 1978 y 1983 en el estado de
Zacatecas se dieron 17 brotes con 108 casos humanos, lo anterior reportado por
la Organización Panamericana de la Salud
(2). El primer brote en Zacatecas fue registrado en 1976 en Laguna del Carretero
municipio de Villanueva con 8 defunciones, y entre 1982 y 1983 Del Río y Col.
Encontraron 8 diafragmas positivos en 51 cadáveres analizados (15).
La implementación de técnicas
directas e indirectas inmunológicas ha resultado favorable para la detección de
T. spiralis en los modelos experimentales rata, ratón y conejo por lo que
la utilización de éstas en el diagnóstico en cerdos vivos y de rastro en la
infección natural, es también factible (16).
OBJETIVOS
1.-Detectar la presencia de
T. spiralis por métodos directos e indirectos a una población de 300
cerdos:
100 muestras de tejido y suero de
cerdos sacrificados provenientes de los rastros de las ciudades de Zacatecas
y Jerez y 200 sueros de cerdos vivos [100 provenientes de traspatio y 100 más
del tipo de explotación tecnificada] de diferentes comunidades del estado de
Zacatecas.
2.-Utilizar el modelo
experimental porcino raza York para el diagnóstico de T. spiralis.
3.-Comparar los resultados
obtenidos por las diferentes técnicas (directas e indirectas) en el modelo
experimental y los cerdos de estudio.
MATERIAL Y MÉTODOS
Sueros y tejidos de cerdos
300 muestras; 200 muestras de sueros provenientes de
diversas comunidades del estado de Zacatecas y 100 sueros y diafragmas de cerdos
provenientes del rastro municipal de las ciudades de Zacatecas y Jerez Zac.
A los diafragmas se les practicaron las técnicas de
compresión y digestión artificial y a los sueros se les practicó la IDD, Dot –
ELISA e IET.
Técnicas directas.
Técnica
directa de compresión de tejido
Para el desarrollo de la técnica de compresión en placa se
necesitaron aproximadamente 0.05 g de carne de cada porción de los cerdos de
estudio (diafragma) a cada muestra se le colocó sobre una laminilla se
comprimió con otra, ocupando una área de 1 X 5 mm. y se observó al microscopio
óptico de luz con el lente 10X (10 aumentos) realizándose el conteo por
campo.
Técnica Directa de digestión
artificial
Se le
realizó también a la carne, esta se llevo a cabo a 37º C por 24 horas según
el método descrito por Del Río y col. con algunas modificaciones (15,16). En
donde aproximadamente 30 g de carne fue dispuesta en un tamiz de tul a forma
de saco, se suspendió en una solución al 3 % de pepsina (10,000 U) y de HCl al
37 % [0.2M] en agua destilada en un embudo de separación, transcurridas las 24
horas se procedió a separar las larvas que se depositaron en el fondo del
embudo, se recolectaron y se procedió a su visualización al microscopio óptico
de luz con el lente 10 X y 20X (fotografía 3).
Técnicas Indirectas.
Obtención del
antígeno soluble total de Trichinella spiralis.
La obtención se llevó a cabo de dos maneras; por
sonicación de un preparado de las LI deT. spiralis en solución pepsina
10,000U –HCl 0.2M (16) y por su extracción mediante Nitrógeno líquido (16) de
la cepa que se ha venido conservando por el cuerpo académico de Biología Celular
y Microbiología de la Universidad Autónoma de Zacatecas (Fotografía.3).
Fotografía 3.- Embudo de separación (1), LI de
T.spiralis obtenidas de la digestión artificial del embudo de separación (2)
(15,16).
Desarrollo de la técnica de IDD
Se elaboró un gel de agar al 1 % en agua con azida de sodio
para evitar contaminación, se colocó en una cantidad de 3
ml a 55° C sobre una laminilla de vidrio,
una vez en forma sólida se procedió a formar la roseta con un horadador
procurando una equidistancia de 0.5 cm. entre pozo y pozo, la confrontación se
hizo colocando siempre el antígeno en una cantidad de 20
mL en
el centro y en torno a este un suero de reactividad conocida en la misma
proporción en volumen sin diluir, dejando en cámara húmeda de 24 a 48 horas
hasta observar líneas de precipitación entre el suero positivo y el antígeno,
luego se procedió a teñir el gel con azul brillante de Coomassie G 250 en un
25 % en volumen (18).
Técnica
de Dot – ELISA
El papel de
nitrocelulosa se cuadriculo de 1 cm2 ocupando un total de 10 cm2
para cada prueba con el fin de que fueran analizados cada vez 100 sueros. Se
pegó el antígeno al papel colocando 1
mL en
cada cuadro lo que equivale a 0.9mg
de AST de T. spiralis, se dejó toda la noche a temperatura ambiente,
bloqueando con leche libre de grasa al 3% al día siguiente por 1 hr. , lavando
por una ocasión con PBS –Tween 20 al 0.5 % con agitación por 10 min., se
colocaron los sueros problema en una cantidad de 1
mL por
cuadro en una dilución, de 1: 100, dejando incubar por 1 hora, lavando
nuevamente con PBS –Tween 20 al 0.5 % por 10 min., y se luego colocó el segundo
anticuerpo Anti- IgG de cerdo conjugado a peroxidasa en dil.1: 2000 en PBS
incubando por 1 hora, lavando con PBS –Tween 20 al 0.5 % por 10 min. por 2
ocasiones por 10 min. , se enjuagó con PBS por 10 min. se reveló con 3-3´
di-amino Benzidina usando peroxido de hidrógeno al 37 % como sustrato (12).
Técnica de
Inmunoelectrotrasferencia (IET).
El producto obtenido del corrimiento en gel de poliacrilamida
se transfirió a papel de nitro celulosa (N C) de acuerdo a lo descrito por
Towbin (19).Utilizando la cámara de Transblot- Cell ( Bio – Rad.)Ò
a 35 voltios, durante toda la noche a 4 ° C.
El papel de NC fue teñido con fast green (verde rápido) por 5
min. con agitación constante, se retiró el colorante y fue decolorado en agua
destilada, para verificar transferencia de las proteínas, se dejó secar y se
cortaron las tiras del ancho aproximado de cada carril ( 0.5 cm).
Transcurrido lo anterior se procedió a cubrir cada tira con
una solución de PBS- leche en polvo al 3% y azida de sodio al 0.15 M a 4 °C,
con agitación constante por toda la noche. En seguida se lavaron 3 veces por 10
min. con PBS, se continuó con la incubación por 1.5 hr. con los sueros de los
cerdos en una dilución de 1:100 en PBS- leche en polvo al 3% a 37 °C con
agitación constante, se lavaron enseguida por dos ocasiones con PBS- Tween 20
al 0.3% por 10 min. y tres más con PBS por 10 min. A continuación se incubó con
el segundo anticuerpo Anti- IgG de cerdo conjugado con peroxidasa 1: 2000 PBS-
leche en polvo al 3% por 1 hr., a temperatura ambiente con agitación, después
se lavaron 2 veces con PBS- Tween 20 al 3% y se enjuagaron con PBS por tres
ocasiones por 10 min. cada una.
El patrón de Bandeo de cada tira se reveló con 3,3´ di-amino
– benzidina (DAB), 50 mg en 100 ml de PBS , usando como sustrato peroxido de
hidrógeno al 37 % (12).
MODELO EXPERIMENTAL
El modelo experimental que fue usado en este estudio constó
de 2 cerdos hembras raza York de 12 meses de edad, divididas en dos
lotes: 1 cerdo infectado con T . spiralis 1 larva infectiva por gramo de
peso, el otro lote consistió en 1 cerdo sin infectar para ser usado como
testigo negativo, sangrándolos semanalmente, hasta un total de doce ocasiones,
los sueros así obtenidos se utilizaron para probar la reactividad antigénica del
AST, así como para probar la eficacia diagnóstica de las diferentes pruebas
indirectas ( IDD, Dot-Elisa y IET) de interés en este estudio.
Una vez transcurridos las 12 semanas, los animales fueron
sacrificados implementándoles la técnica de compresión en placa de los tejidos:
diafragma, lengua, masetero y pierna, 30 gramos de carne se sometieron a
digestión artificial y en el modelo experimental un fragmento de .5 cm. de los
tejidos mencionados fue fijado en formol para su procesamiento en la técnica
de Hematoxilina-Eosina.
Tinción
con Hematoxilina - Eosina
El tejido fue fijado en formol al 10% para cortes
histológicos con el fin de determinar las características por tinción de
Hematoxilina _Eosina de la célula Nodriza. Los tejidos se
deshidrataron para luego procesarlos en parafina. Esto fue llevado a cabo en el
aparato procesador de tejido (Lipshaw Automatic Tissue Processor) de acuerdo a
los siguientes pasos:
Formol al 10 % por 12 horas alcohol etílico al 80% por 1
hora alcohol etílico del 96% 3 cambios cada uno de 30 min. , Alcohol etílico
absoluto 3 cambios de 1. 5 horas cada uno, Xileno 2 cambios de 1.5 horas y por
último parafina a 60 °C., 2 cambios de 1.5 horas, se colocaron los tejidos en
moldes cúbicos con ésta hasta enfriar.
Luego de 24 horas se colocan en cama de hielo para efectuar
los cortes, teniendo cada uno un grosor de 4m
en el Microtómo modelo 820 rotary, American Optical. Posteriormente se colocó
en un portaobjetos cubriéndolos luego con un gel hecho a base de clara de huevo
y glicerol (1:1) más unos granos de tibol como conservador. Los cortes así
tratados se colocaron en placa caliente para fundir la parafina y continuar con
la tinción con Hematoxilina – Eosina, tal como lo describe el libro de las
Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Norteamérica (17).
El proceso de tinción se llevó a cabo en un tren de tinción:
los portaobjetos se colocaron en una canastilla misma que fue introducida en las
siguientes soluciones; : Xileno 5min., xileno 5 min., alcohol etílico absoluto 3
min., Alcohol etílico al 96% 3 min., alcohol etílico al 96% 3 min., agua
potable y agua destilada (de manera rápida), Hematoxilina de Harris ( por unos
segundos) agua potable, alcohol ácido al 1 % (de manera rápida) agua potable,
solución saturada de carbonato de litio 2 min. , agua potable-Eosina (por unos
segundos) agua potable dos cambios en alcohol etílico al 96 %, 3 cambios en
alcohol etílico absoluto, Xileno (todos los pasos anteriores son de 1min.) se
mantuvieron las laminillas mientras se fueron montando con resina sintética
Sigma
â
y se cubrieron con cubreobjetos quedando listas para su observación al
microscopio óptico de luz.
RESULTADOS
Caracterización
del antígeno soluble total de
T. spiralis.
La concentración proteica del
antígeno fue de 90 mg
/ mL
.
Su corrimiento en geles de
poliacrilamida mostró un bandeo comprendido entre 24 - 97 kDa. predominando el
triplete de 43,45 y 48 kDa. Característico de T. spiralis, utilizado
paras las técnicas indirectas de IDD, Dot-ELISA y IET.
Técnicas directas en el modelo experimental en
cerdo
Por la técnica de digestión
artificial se encontraron 25 mL
de LI, aproximadamente cada microlito contiene 25 LI.
En cuanto a la técnica de
compresión del tejido se encontraron aproximadamente entre 10-14 LI por campo
(fotografía 4).
Fotografía 4.- Técnica directa de compresión de tejido de diafragma de cerdo
infectado experimentalmente con T. spiralis observado a 10 X en
microscopio óptico de luz.
En la
tinción con Hematoxilina –Eosina se encontró el mismo patrón de célula Nodriza
que se presenta en el modelo experimental murino que está ya bien caracterizado
(2,16) (fotografía 5).
Fotografía 5.- Técnica de Hematoxilina-Eosina en tejido de pierna de cerdo
infectado experimentalmente con T. spiralis con el patrón de célula
nodriza característico.
Técnicas indirectas en el modelo experimental
en cerdo
Se
encontró una positividad en IDD hasta la cuarta semana, por Dot -ELISA a la
tercera semana mostró positividad, por el método de IET a la segunda semana se
encontraron resultados positivos reconociendo el triplete característico de 43,
45 y 48 kDa.
Técnicas directas en los
animales de estudio
De los
tejidos analizados de los cerdos del rastro, el resultado obtenido por la
técnica de compresión de tejido en placa fue de un diafragma positivo con 1.5
larvas por campo (Foto 6), representando el 0 .3 % de positividad.
Fotografía
6.- Técnica de compresión de tejido de diafragma de cerdo sacrificado en el
rastro municipal de Jerez Zacatecas observada al microscopio óptico de luz 20X.
Por la
técnica de digestión artificial se encontró con 10
mL de
LI del digerido, siendo el mismo de la técnica anterior.
Por el
método de IDD realizado se encontró que el 100% fue negativo, para el total de
los 300 sueros.
Al realizar
la técnica de Dot –ELISA a los sueros del rastro, se obtuvo un valor del 6.00 %
de positividad (6 sueros) (Fotografía 7 B).
Los
resultados obtenidos en los sueros de los cerdos de los dos tipos de
explotación; traspatio y tecnificada, fueron 5 y 5 positivos respectivamente
(Fotografía 7 A y C) .
A B
C
Fotografía 7.- Técnica de Dot. ELISA
Dot ELISA aplicada a cerdos de traspatio ( A ), los puntos obscuros son los
positivos (5+) y los 3 puntos obscuros juntos el control positivo.
Dot ELISA aplicada a sueros de cerdos
de rastro ( B ),los puntos obscuros son los sueros positivos(6+).
Dot ELISA aplicada a los sueros de
cerdos con explotación tecnificada ( C ) los puntos obscuros son los positivos
(5+). En la parte inferior de ( C ) 3 controles negativos.
Mediante la
utilización de la metodología de IET para la detección de T. spiralis en
los sueros de los cerdos, se encontraron un total de 16 positivos (Fotografía
8 ) con el predominio del triplete de 42,45 y 48 kDa, los mismos hallados por
Dot-ELISA, en el total de los 300 sueros.
Fotografía 8.- IET, A: sueros positivos de cerdos de
los dos tipos de explotación. Tecnificada y traspatio B: 2 sueros
positivos control y C 3 sueros negativos control. En los positivos el *El
triplete característico de 42,45 y 48 kDa.
DISCUSIÓN
Al realizar
las técnicas directas e indirectas en animales infectados experimentalmente
encontramos resultados positivos, pero nuestro modelo experimental fue
infectado con 1 LI por gramo de peso del cerdo. Al llevarlas a cabo con
animales silvestres, el desarrollo de la técnica de IDD ha dado negatividad al
100% de los sueros lo cual indica que quizás para sueros con niveles de
anticuerpos bajos, y por ende una baja carga parasitaria
< 1.5
LI por campo y con poco tiempo de infección esta técnica no resulta adecuada.
Al detectar anticuerpos anti
T. spiralis por las técnicas de Dot-ELISA y por IET en un numero de 16
en sueros reportados como negativos por IDD, digestión y compresión en placa,
concluimos que la técnica de Dot-ELISA puede ser usada para grandes tamices de
diagnóstico para Trichinellosis porcina, la técnica de IET es adecuada cuando
de especificidad se trata como método diagnóstico en Trichinellosis.
Desafortunadamente T. spiralis
sigue presente como una zoonosis endémica en Zacatecas, México, que es
diagnosticada solo en brotes epidémicos.
Y al no realizar de forma
rutinaria inspección para T. spiralis en carne de cerdo en los rastros
permite su trasmisión al humano y aunque sea baja la carga parasitaria si
impacta en la calidad de vida de este.
Siendo importante implementar como
tamiz la Dot-ELISA ya que es rápida y de bajo costo y no se necesita una gran
infraestructura.
Conclusión
La Trichinellosis sigue como
zoonosis en el estado de Zacatecas, sin llevarse un diagnóstico sanitario.
La técnica de Dot-Elisa es una
alternativa para un diagnóstico rápido y de bajo costo, específico y sensible.
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