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Caracterización de Parámetros Inmunitarios y
Hormonales en Yeguas Susceptibles y Resistentes a Endometritis.
Fumuso y cols.
Hipótesis general:La condición
de la yegua de ser susceptible o resistente a endometritis se debe a
diferencias en las subpoblaciones leucocitarias y en las concentraciones
hormonales y de interleuquinas
1. Introducción:
La endometritis es una de las
causas más importantes de infertilidad en la yegua y tiene un impacto
económico negativo sobre la industria equina (21)
De acuerdo con los
conocimientos actuales sobre etiología y patogenia, la endometritis puede
considerarse como un desorden multifactorial, con al menos cuatro posibles
manifestaciones: (a) endometritis aguda: transitoria luego del servicio o por
enfermedades venéreas, (b) endometritis infecciosa crónica, (c) endometritis
persistente post-servicio y (d) endometrosis (endometritis degenerativa
crónica)
Mientras que las infecciones
uterinas agudas curan ya sea espontáneamente o con terapéutica antimicrobiana
local, las afecciones crónicas y la endometritis post-coital pueden persistir
a pesar de la terapéutica antedicha. Esta diferencia llevó a clasificar a las
yeguas en "susceptibles" (YS) o "resistentes" (YR) a endometritis y a estudiar
el problema, con diferentes enfoques (23, 21, 30).
La eliminación de las
infecciones uterinas involucra mecanismos inmunitarios innatos y adaptativos,
siendo los más importantes: la opsonización de las bacterias por los
anticuerpos, la destrucción de las bacterias y otros “elementos extraños” como
los espermatozoides por las células fagocitarias y la remoción física de los
productos de la inflamación por drenaje favorecido por las contracciones
uterinas (20, 21, 22, 27, 10).
Muchos estudios han buscado
evaluar los mecanismos de defensa en YR y YS para determinar a qué nivel se
producían las deficiencias. En la actividad muscular juega un papel
importante en la eliminación del fluido uterino (9,2,21). La acumulación de
fluido inflamatorio en el útero de las YS se debe a la imposibilidad de
eliminarlo a través del cervix y del drenaje linfático por medio de las
contracciones uterinas (9).
En efecto, por electromiografía
se observó que las YS sufrían un deterioro (en cantidad e intensidad) de las
contracciones miometriales, respecto de las YR, cuando se las desafiaba con un
inoculo bacteriano intrauterino.
El tiempo en que una yegua
puede resolver la inflamación y/o infección es crítico para la conservación de
la preñez. Teniendo en cuenta que el óvulo fertilizado permanece en el
oviducto sólo hasta el día 5, durante ese lapso el útero debe eliminar toda
inflamación para proveer un medio compatible con la sobrevida del embrión.
Se debe enfatizar que no sólo
las bacterias en el semen sino los espermatozoides per-se provocan inflamación
luego del servicio. Es decir que siempre tras el coito se produce una
inflamación transitoria del endometrio y que la fertilidad de una yegua es
dependiente de su capacidad para resolverla (7, 30, 21).
Frayne y Stokes (4) y Watson y
Thomson (29) estudiaron células con marcadores MHC-II y algunas subpoblaciones
de linfocitos endometriales, a lo largo del ciclo, en YR y YS sanas y con
endometritis. Aunque inicialmente se pensaba que podía haber deficiencias en
el número de células presentadoras de antígeno en las YS(28), esto no fue
confirmado por estos ensayos: contrariamente a lo esperado, en las yeguas con
endometritis había mayor concentración de células que expresan MHC-II.
El interés del estudio de los
leucocitos en el tracto genital excede el de su rol en la remodelación de
tejidos y en la inmunidad; recientemente se ha visto que los leucocitos
responden al desafío espermático y a cambios endocrinos durante el ciclo
estral y la gestación con secreción de citoquinas (26).
En reproducción, el rol
de las citoquinas ha sido motivo de numerosas investigaciones. Hurwitz y cols
(6), estudiando la luteólisis, expusieron células de cuerpo lúteo de ratas a
la acción de IL1 y detectaron un efecto sinérgico para la producción de PGE y
PF2a
y una disminución significativa de los niveles de progesterona.
Esto sugiere una función
directa autócrina/parácrina para la IL1, en el mantenimiento o la regresión
del cuerpo lúteo. Por su parte, Semer y cols. (18), realizaron tres grandes
hallazgos a nivel de endometrio: (i) las células del endometrio humano
responden a la acción de IL1 con un incremento en la producción de
prostaglandinas, IL1 e IL6; (ii) tanto IL1 como TNFa
actúan en las células estromales para estimular la síntesis de IL6 y, (iii) la
IL1 actúa sobre las células del estroma endometrial inhibiendo la expresión de
RNAm para conexina 43, principal proteína de las uniones estrechas en músculos
cardíaco y liso.
Las uniones estrechas son clave
para la conducción de las señales eléctricas y la sincronización de las
contracciones miometriales (1). Es probable que la acción de la IL1 lleve a
una disminución en la comunicación entre las células del estroma endometrial,
dependiente de aquellas.
Las citoquinas también han sido
relacionadas con estados patológicos. Mitchel y cols. (13), hallaron que los
niveles de IL6 requeridos para estimular la producción de prostaglandinas por
células del amnios y la decidua, in-vitro, coinciden con los presentes en el
fluido amniótico de pacientes con infección uterina y parto prematuro. Esto
sugiere que, en casos de infección, la IL6 podía contribuir a dicho adelanto.
Asimismo, Naz y cols.
(15) hallaron niveles más altos de TNFa
(en exudado cervical) y de IFNg
(en suero y exudado cervical) en mujeres infértiles, comparado con controles
fértiles. Es pues probable, que en equinos, las citoquinas IL1, IL6 y TNFa
tengan efectos análogos a los hallados en los casos de infertilidad e
infecciones citados.
Teniendo en cuenta la
importancia de los mecanismos inmunitarios en el control de la endometritis,
se ha evaluado en diferentes especies el uso de inmunomoduladores para mejorar
la eficiencia reproductiva. Un extracto de pared de Mycobacterium fue objeto
de estudio en yeguas repetidoras; sobre 43 yeguas tratadas al inicio del celo,
39 resolvieron la inflamación y tuvieron altas tasas de preñez y sobrevida
fetal,. incluso aquellas con antecedentes de mortalidad embrionaria (25).
El conocimiento de las
interrelaciones entre los sistemas inmunitario, endocrino y nervioso, podría
favorecer el desarrollo de nuevos métodos para el diagnóstico y tratamiento de
la infertilidad, incluyendo la inmunomodulación, como así también el
mejoramiento de las técnicas de manejo durante el celo y la gestación
temprana.
2. Objetivo General:
El propósito de este proyecto
es caracterizar la situación de las subpoblaciones leucocitarias, las
interleuquinas y las hormonas (estrógenos, progesterona y prostaglandinas) de
las yeguas en relación con la susceptibilidad a la endometritis y estudiar las
modificaciones que ocasionaría el uso de un inmunomodulador en estos
parámetros.
3. Diseño estadístico:
En este proyecto se desea
evaluar las diferencias entre dos grupos de animales (YS, YR) para las
variables IL6, IL1, TNF, CD4, CD8, MHCII, CB, Estrógenos, Progesterona y PGF2a.
El número de unidades
experimentales a incluir se determinó en 15 a partir de la curva
característica de operación (Prueba 1-b)
(14)
Los valores iniciales para el
cálculo se estimaron sobre la base de referencias previas5
Según esta prueba se deben tomar entre 12 y 15 unidades experimentales por
grupo, para poder detectar el efecto de tratamientos propuesto, con un error
de tipo II aceptable.
En función de los objetivos
propuestos, el análisis estadístico de los resultados tendrá dos partes. La
comparación de medias de las variables respuestas, mediante prueba “t”, y, por
otra parte el grado de relación existente entre las variables mediante la
correlación de Pearson. En ambos casos se utilizara el programa estadístico
SAS (17)
4. Clasificación de las
yeguas:
Ubicación geográfica: Ayacucho,
Provincia de Buenos Aires, Argentina.
Epoca del año: La clasificación
de las yeguas se realizó entre el 16 de febrero y el 16 de abril de 1999. El
ensayo se realizó durante la temporada de servicio del mismo año.
Criterio de selección de los
animales: a partir de 2000 yeguas livianas, se realizó palpación transrrectal
y ultrasonografía para seleccionar yeguas vacías, que reunieron las siguientes
condiciones:
Conformación vulvar: Grado III
o IV, según la escala: Grado I: malo, Grado II: regular, Grado III: bueno,
Grado IV: excelente. (12)
Estado corporal: Grado III o IV,
según la escala: Grado I: malo, Grado II: regular, Grado III: bueno, Grado IV:
excelente. (12)
Tractos reproductivos normales:
según lo determinado por palpación transrrectal, sin quistes endometriales
detectables por ultrasonografía.
Ovulatorias: determinando por
ultrasonografía ovárica transrrectal la presencia al menos de un cuerpo lúteo
activo. (5)
Categorización de las yeguas:
La selección se hizo sobre 51
yeguas teniendo en cuenta:
-
La historia reproductiva:
recabada de los antecedentes de preñez del establecimiento.
-
La prueba funcional con
inoculación de Streptococcus equi subsp. zooepidemicus y control a las 72h
con ultrasonografía, cultivo microbiológico y citología exfoliativa. La
interpretación se basó en un “score” que asignaba el valor de 1 a la
presencia de fluido, al cultivo o la citología positiva y 0 a la ausencia de
fluido, citología negativa y cultivo negativo. De tal forma las yeguas que
daban 0 o 1 a la sumatoria de las tres pruebas quedaban como resistentes y
las que daban 2 o 3 quedaban como susceptibles.
-
La prueba biológica de
servicio y control de preñez. Se dio servicio con padrillos de fertilidad
comprobada en una sola manada.
Resultados del grupo total:
|
Categoría (n)
|
Buenos anteced. rep. |
Preñez |
|
Resistentes (31) |
18/31 (58,1 %) |
15/31 (48,4 %)
|
|
Susceptibles (20) |
2/20 (10,0%) |
2/20 (10,0 %)
|
De acuerdo con esto se formaron
dos grupos de 16 yeguas cada uno, con las siguientes características
Resultados en las yeguas
seleccionadas:
|
Categoría
|
Buenos anteced. Reproductivos. |
Preñez |
|
Resistentes (16)
|
13/16 (81,3%) |
14/16 (87,5%) |
|
Susceptibles (16) |
0/16 (0%)
|
1/16 (6,25%)
|
Las yeguas fueron pareadas por
edad y el tipo de lesiones histopatológicas, seleccionando dos grupos
homogéneos entre sí.
|
Categoría (n) |
Edad
(años) |
Categoría
I |
Categoría
IIA |
Categoría
IIB |
Categoría
III |
|
Resistentes (16)
|
7,43 |
2 |
13 |
1 |
0 |
|
Susceptibles (16)
|
7,50 |
0 |
10 |
5 |
1 |
5. Diseño experimental:
El diseño se basó en tres
secciones experimentales, el cronograma del ensayo lo podemos visualizar en el
siguiente gráfico.
5.1. Sección experimental 1:
5.1.1.Hipótesis
Los niveles de interleuquinas,
las subpoblaciones de linfocitos y los niveles de prostaglandinas son
diferentes, tanto durante el estro como en el diestro, entre yeguas
susceptibles y resistentes a endometritis.
5.1.2. Objetivos particulares:
Comparar en ambos grupos de
yeguas:
-
Los niveles de interleuquinas
y las concentraciones hormonales.
-
Las relaciones entre el
número y distribución de CD4+, CD8+, MHCII+,
Células B, en el útero y concentraciones hormonales.
-
El número y distribución de
las poblaciones CD4+, CD8+, MHCII+, C B con
los niveles de interleuquinas en el útero y en el plasma.
-
Los niveles de interleuquinas
uterinas y plasmáticas en los diferentes períodos.
-
Finalmente se compararán los
parámetros anteriormente citados en YS y YR, entre sí, en los dos muestreos
5.1.3. Metodología
Trabajamos con 16 yeguas
susceptibles y 16 resistentes a endometritis.
El primer muestreo se
realizó durante el pico de estrógenos, considerándose como tal el día en que
las yeguas presentaron folículos de tamaño igual o mayor a 35 mm; teniendo en
cuenta los resultados de Sharp (19), que indican que la biopsia en estro no
produce estímulo para la secreción de PGF2a.
Luego del muestreo de estro se administró hCG, para acortar el período de
ovulación.
El segundo muestreo se realizó
durante el día 7±-1 posterior a la ovulación, luego del cual se administró
prostaglandina para acelerar la luteólisis.
Se evaluarán los cambios
en las concentraciones plasmáticas de 17b
estradiol, 15-cetodihidro prostaglandina F2a
, progesterona, IL1, TNF e IL6.
A través de las biopsias
endometriales se estudiará la presencia y distribución de PMN y las
poblaciones celulares CD4+, CD8+, MHCII+, Células B y las concentraciones de
IL1, TNF, IL6 y de PGF2a.
5.2. Sección experimental II
5.2.1. Hipótesis:
Las yeguas susceptibles y las
resistentes responden de manera diferente al estímulo antigénico del servicio,
lo que se refleja en las concentraciones de interleuquinas, las subpoblaciones
de linfocitos y los niveles de prostaglandinas.
5.2.2. Objetivos particulares:
Comparar en ambos grupos de
yeguas, antes y después del estímulo antigénico del servicio:
-
Los niveles de interleuquinas
y las concentraciones hormonales.
-
Las relaciones entre el
número y distribución de células CD4+, CD8+, MHCII+, LB en el útero y
concentraciones hormonales.
-
El número y distribución de
células CD4+, CD8+, MHCII+, LB, con los niveles de interleuquinas en el
útero y plasma.
-
Los niveles de interleuquinas
uterinas y plasmáticas.
-
Finalmente se compararán los
parámetros anteriormente citados en YS y YR, entre sí, en los dos muestreos.
5.2.3
Metodología
Se trabajó con los mismos
grupos que en la sección experimental 1.
El servicio se realizó con
semen muerto, a partir del momento en que las yeguas presentaron folículos de
al menos 35 mm. La primera muestra se tomó a las 24h de la inseminación. La
segunda muestra se tomó el día 7±1 posterior a la ovulación. El control del
ciclo se hizo de la misma forma que en la sección experimental 1
Se evaluarán los mismos
parámetros que en la sección experimental 1.
5.3 Sección experimental 3
5.3.1. Hipótesis
Las yeguas susceptibles y las
resistentes responden de manera diferente al estímulo antigénico del servicio,
cuando son sometidas a la inmunomodulación, lo que se refleja en las
concentraciones de interleuquinas, las subpoblaciones de linfocitos y los
niveles de prostaglandinas.
5.2.2 Objetivos particulares:
-
Comparar en ambos grupos de
yeguas, antes y después del estímulo antigénico del servicio cuando se
administra un inmunomodulador:
-
Los niveles de interleuquinas
y las concentraciones hormonales.
-
Las relaciones entre el
número y distribución de células CD4+, CD8+, MHCII+, LB en el útero y
concentraciones hormonales
El número y distribución de
células CD4+, CD8+, MHCII+, LB, con los niveles de interleuquinas en el útero
y plasma.
Los niveles de interleuquinas
uterinas y plasmáticas.
Finalmente se compararán los
parámetros anteriormente citados en YS y YR, entre sí, en los dos muestreos.
5.3.2. Metodología
Se trabajó con los mismos
grupos que en la sección experimental 2.
Cuando las yeguas presentaron
folículos de 35 mm, se administró un inmunomodulador (Equimune IV, Vetrepharm),
de acuerdo con las indicaciones del laboratorio y se realizó inseminación
artificial con semen muerto, al igual que en la sección experimental 2.
La primera muestra se tomó a
las 24h de la inseminación. La segunda muestra se tomó el día 7±1 posterior a
la ovulación. El control del ciclo se hizo de la misma forma que en las
secciones experimentales 1 y 2
6. Materiales y métodos
Ecografía genital:
Se realizó con un ecógrafo con
transductor lineal dual de 5 mz (Pie Medical, 360 Vet),. El objetivo de la
misma fue evaluar en ovarios, presencia y tamaños de folículos y a nivel
endometrial, presencia de edema, fluido libre y gestación.
Muestras para cultivo:
Fueron tomadas con hisopos
protegidos y colocadas para su transporte en medio Amies (Oxoid). Las muestras
fueron cultivadas en aerofilia y microaerofilia. Los antibiogramas se hicieron
según normas del National Commitee of Clinical Laboratory Standards (16)
Citología exfoliativa
endometrial:
Se tomaron muestras
endometriales por hisopado de la superficie. Estas muestras se extendieron en
portaobjetos y se colorearon inmediatamente después de tomadas (Tinción 15''
Biopur). Se evaluaron por una escala basada en el número de PMN, promediando
20 campos (400 X). Grado I: 0 a 3, Grado II 4 a 10, Grado III 11 a 100, Grado
IV más de 100, (12).
Biopsia endometrial:
Se tomaron las muestras con una
pinza de biopsia, especialmente diseñada para equinos. Las muestras sé
incluyeron en líquido fijador de Bouin y luego en etanol al 70% hasta su
procesamiento. Estas muestras se utilizaron para las tinciones comunes con
hematoxilina y eosina y para las técnicas de inmunohistoquímica en el estudio
de las poblaciones de linfocitos. Para las determinaciones de interleuquinas,
las muestras se conservaron congeladas en nitrógeno líquido, sin fijación.
La interpretación de las
muestras coloreadas por H&E se hizo según las escalas de Kenney y Doig (8) y
de Miragaya y cols. (12).
Inóculo bacteriano:
Las yeguas fueron inoculadas
por vía intrauterina con Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (50 ml de una
suspensión 5x106/ml de PBS). (protocolo cedido gentilmente por M. LeBlanc[1]).
Servicio :
Se realizó en forma natural;
las yeguas permanecieron con los padrillos durante dos ciclos.
Muestras de plasma:
Se obtuvo una muestra de sangre
periférica, en tubos Vacutainer3
con heparina; la centrifugación se realizó inmediatamente y una vez separado
el plasma, el mismo fue conservado congelado en nitrógeno liquido hasta su
uso.
Ensayos Hormonales:
Mediante
radioinmunoensayo se dosarán las concentraciones plasmáticas de: 17
b
estradiol y 15-ceto-13-14-dihidro-PGF2
a, y
progesterona por ELISA; todas las pruebas serán validadas antes de su uso.
Interleuquinas:
La actividad de IL6 se
cuantificará por un ensayo biológico utilizando células B9, basado en la
determinación por interpolación de la dilución exacta de muestra que causa el
50% de la máxima proliferación posible de las mismas. La actividad de IL1 se
evaluará de manera similar en células D10G4. La actividad de TNF se
determinará por un ensayo de citotoxicidad en células L929. Los protocolos
para estos ensayos fueron gentilmente cedidos por R. J.MacKay 4
Subpoblaciones celulares de
macrófagos y linfocitos:
Se determinarán en las muestras
de biopsia, por técnicas de inmunohistoquímica con los siguientes anticuerpos
monoclonales(VMRD. Inc): TH14B, que reacciona con MHC Class II; HB61A, (CD4);
HT14A, (CD8); MAC292, (células B).
Procedimiento para obtener el
semen muerto:
Se utilizó semen de cuatro
padrillos de fertilidad comprobada recogido con vagina artificial tipo
Missouri. Se realizó un pool que se llevó a la dosis de 5 x 108
espermatozoides (con motilidad progresiva), con diluyente de Kenney sin
antibiótico. El semen se sometió al proceso de congelación a –20°C y
descongelación para producir la muerte de los espermatozoides. Se conservó a
–20°C hasta su uso.
7. Grado de avance:
Se cumplieron las etapas de
selección y clasificación de las yeguas, entre los meses de febrero a mayo de
1999.
Se realizaron los tres ensayos
de campo entre los meses de octubre y diciembre de 1999
Actualmente se han procesado
las muestras de histopatología y estamos poniendo a punto las técnicas de
inmunohistoquímica.
Large Animal Clinical
Sciences College of Veterinary Medicine University of Florida
3 (Becton
Dickinson, USA)
4 Large Animal
Clinical Sciences College of Veterinary Medicine University of Florida
5 Cadario,ME
Relationship between protaglandin secretion ,intrauterine fluid and uterine
clearance in reproductively normal mares and mares with delayed uterine
clearance; enviado para su pubicación a Theriogenology
Fuente:
AAVE - www.aave.org.ar
