Resumen
La salmonelosis es una de las
infecciones más importantes que afecta al humano y a los animales. En este
sentido la Secretaria de Salud reporta anualmente un promedio de 68,000 casos
de infecciones causadas por bacterias del género Salmonella. El objetivo
del presente trabajo fue determinar la frecuencia del gene de la integrasa clase
I y el perfil de resistencia antimicrobiana en S. enteritidis aisladas a
partir de pollos y humanos.
Fueron analizadas cincuenta y
siete cepas de S. enteritidis aisladas de aves en diferentes granjas
avícolas del país y de humanos.
La sensibilidad antimicrobiana
fue determinada con un sistema automatizado en microplacas (MicroScan System-D)
y por medio de difusión en agar de acuerdo al procedimiento recomendado por la
Food and Drug Adminstration (FDA). Del total de cepas de S.
enteritidis analizadas con el sistema en microplacas, la resistencia a
diferentes antibióticos fue la siguiente: el 21.4% para la combinación
trimetropin-sulfametaxazol, el 11.4% fue para ceftazidima, el 8% para
penicilina, el 6.6% fue para imipenen y el 5.3% presentaron resistencia a
piperacilina y a la conbinación ampicilina-sulfametoxasol. En el análisis por
medio de difusión en agar se observó que el 97% de las cepas presentaron
resistencia a nitrofurantoina y carbenicilina, mientras que el 88% de las cepas
presentó resistencia a gentamicina. Por lo que corresponde, a cefalotina y
amikacina el patrón de resistencia fue del 77% y 74.3% respectivamente. Todas
las cepas amplificaron un fragmento de 500 pb el cual corresponde a la subunidad
16S ribosomal. De todas las cepas analizadas, el 38% amplificaron un fragmento
de aproximadamente 900 pb el cual corresponde al gene de la integrasa I. Por
otro lado, hay que considerar que en la industria pecuaria se utilizan algunos
antibióticos como promotores del crecimiento y esto puede generar dicha
resistencia.
Trabajo financiado
parcialmente por el proyecto:
CONACYT-34747-B.
INTRODUCCION
La salmonelosis es una de las
infecciones más importantes que afecta al humano y a los animales. En México la
Secretaria de Salud reporta anualmente un promedio de 68,000 casos de
infecciones causadas por bacterias del género Salmonella. En los
serotipos S. enteritidis, S. typhimurium, S gallinarum y S.
choleraesuis se ha observado multirresistencia a varios antibióticos (1,2).
La salmonelosis es una enfermedad de origen alimentario, la fuente mas frecuente
de infección son los alimentos contaminados por mal manejo o procedentes de
animales enfermos. (1).
Las bacterias requieren de factores de virulencia para colonizar y sobrevivir
dentro de las células hospederas ya sea evadiendo las defensas del hospedero o
multiplicándose dentro de este. A través de la evolución, las bacterias han
intercambiado su material genético para adaptarse y sobrevivir en diferentes
condiciones. La transferencia horizontal de material genético ha jugado un papel
importante para adquirir varias características entre géneros o especies
bacterianas (3).
En S. typhimurium, S.
gallinarum, S.
enteritidis y S.
choleraesuis se han encontrado plásmidos de alto peso molecular (50 a 100
kb) donde se encuentran genes que codifican para toxinas así como genes que
confieren multirresistencia a diferentes antibióticos (4, 5, 6).
La resistencia microbiana es la pérdida de la sensibilidad de un microorganismo
a un antimicrobiano al que originalmente era susceptible. Esta resistencia puede
adquirirse por mutaciones en el DNA cromosomal o por la adquisición de material
genético extracromosómico a través de plásmidos y transposones. La resistencia
antimicrobiana se puede adquirir por: conjugación, transducción y
transformación. En la conjugación se transfieren genes de resistencia desde
una bacteria a otra por medio de un plásmido. En la transducción un gen de
resistencia se integra a una bacteria a través de un virus y por último, la
transformación donde hay captación
y asimilación
de genes liberados del medio
externo de bacterias muertas (5).
Los mecanismos de resistencia
antimicrobiana actúan: Impidiendo el acceso del antimicrobiano al lugar
específico de acción, eliminado o expulsando el antibiótico para evitar que
pueda acceder a su sitio de acción, Inactivando o modificando la estructura
química del antimicrobiano, alterando o incrementando la producción del sitio de
acción y finalmente desarrollando vías metabólicas alternas que suplan la
inhibida por el antibiótico (7)
En S. enteritidis la
resistencia a ampicilina, se sulfonamidas, y tetraciclina sola o asociada con
aminoglicosidos (ACSSuT). Estudios moleculares en S. enteritidis han
demostrado que los genes de resistencia responsables para los fenotipos ACSSuT
se localizan dentro de integrones. (8).
Por otro lado, se ha observado
que muchas bacterias entéricas son resistentes a tetraciclinas y que
posiblemente los genes que codifique esta resistencia sean codificados dentro de
plásmidos de 80 y 30 kb. (8).
También se han
encontrado genes en transposones formado por dos secuencias de inserción (IS) en
fenotipos bacterianos que son resistentes a varios antibióticos o metales
pesados.
Dentro de estos
transposones se encuentran genes estructurales organizados como un operón, a
los que se les denomina integrones. Los transposones, Tn10, Tn5, Tn9, codifican
de resistencia para tetraciclina (TetR), kanamicina (KmR),
estreptomicina (StrR) y cloramfenicol (CmR). Un integrón
estructuralmente esta compuesto de tres regiones: Una región constante 5’que
contiene básicamente el gen de la integrasa, una región central variable donde
se localizan los genes estructurales del integrón para regular genes de
resistencia a antibióticos. La región constante 5’ y central variable están
separadas por la secuencia att1 que es uno de los sitios de reconocimiento de la
integrasa.
El uso excesivo de antibióticos
ha provocado la aparición de bacterias resistentes a un gran número de
antibióticos que se utilizan para el tratamiento en humanos y los animales, lo
cual prolonga el tiempo de la enfermad y posiblemente sean más severas, además
de que pueden causar problemas alérgicos. Basados en los resultados encontrados
en varias serotipos del género Salmonella, postulamos la hipótesis de que
la mayoría de los aislamientos obtenidos a partir de casos clínicos son
resistentes a varios antibióticos y portan el gene de la integrasa clase I
involucrado en la multirresistencia antimicrobiana.
2. OBJETIVO
GENERAL
Determinar el perfil de la
resistencia antimicrobiana y la presencia del integrón clase I en S.
enteritidis y
S. gallinarum
aisladas a partir de casos clínicos en humanos y aves.
3. MATERIALES Y
METODOS
Cepas utilizadas
y condiciones de cultivo.
Se estudiaron
cincuenta y siete cepas de S. enteritidis
aisladas de aves y de humanos, 11 de S. gallinarum y 2 de S.
typhi, 3 cepas de E. coli enterotoxigenica (ETEC) obtenidas a partir
de casos clínicos previamente
serotipificadas con antisueros somáticos
y flagelares (O, H) y posteriormente fagotipificadas (9, 10). Para
determinar la sensibilidad antimicrobiana
las bacterias se cultivaron en
agar nutritivo, posteriormente fueron crecidas 4 h en caldo Mueller Hinton a 37ºC
y sembradas en agar Mueller
Hinton durante 24 h 37ºC.
Como cepas
controles se utilizó ETEC multirresistente.
Difusión en placa para
determinar la sensibilidad antimicrobiana.
Las bacterias serán incubadas
en 10 ml de medio Luria-Bertani durante
18 h a 37 ºC con
agitación orbital a 200 revoluciones, posteriormente
los microorganismos se
sembraran con un inoculo conteniendo una concentración aproximada de 108
UFC/ml en placas de Petri con agar Mueller Hinton. Se colocaran sobre cada
una de las placas de petri, multidiscos con 12 discos de papel impregnados con
cantidades conocidas de antibiótico. Las bacterias se incubaron durante entre 24
hs a 37 °C y después se observaran las placas y se determinó el diámetro del
halo de inhibición. La resistencia antimicrobiana se interpretara por ausencia
de un halo de acuerdo a la tabla estándar para bacterias gramnegativos (Fig.
1). La sensibilidad se determinara con la presencia de un halo, considerando
un mayor efecto del antibiótico cuando diámetro sea mayor (11).
Concentración
mínima inhibitoria (CMI)
La CMI fue determinada con el
método de dilución en microplaca.
Las bacterias se incubaron en medio de Mueller
Hinton durante 18 h a 37
ºC, posteriormente se prepara el inoculo
conteniendo una concentración aproximada de 3 X 108 UFC/ml y se
adicionó la suspensión estándar de bacterias sobre microplacas conteniendo una
serie de doce antibióticos (A/S,
Pi, Cfz, Cfx, Crm, Cft, Gm, Ak, Imp, T/S, Caz, Azt)
para bacterias GAM-negativas y se incubaron a 35ºC
durante 24 h aproximadamente. La lectura de las microplacas para determinar la
CMI de los organismos se determinó en un equipo automatizado (microscan).
Purificación de
DNA de Salmonella.
Se cultivaron las
bacterias en 10 ml de caldo LB a 37°C durante 24 hrs., posteriormente se obtuvo
el paquete bacteriano por centrifugación a 8000 rpm durante 15 min y el DNA
fue obtenido por medio de un kit (extratagene). El DNA fue visualizado en un gel
de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio y conservado a menos 20°C para
utilizarlo en posteriores trabajos.
Amplificación de
la región 16s ribosomal.
Para evaluar la
integridad del DNA se emplearon dos oligonucleótisos específicos del gene 16sr
ribosomal.
Los oligonucleotidos de la subunidad 16sr son los siguientes: 5’AGTTTGATCATGGCTCAG3’
Y 3TTACCGCGGCTGGCA5 (12).
La reacción de PCR se realizó de la
siguiente manera: buffer MgCl2 1X, 100 ng de cada uno de los
oligonucleotidos, 0,5 µL DNATaq polimerasa (Promega), 1 µL de dNTPs y 50 µL H2O.
1 µL DNA de salmonella (12,13).
La amplificación fue llevada a
cabo, iniciado con una desnaturalización de 5 min a 94°C , seguido de 30 ciclos
a 94°C durante 45 seg., alineamiento a 50°C durante 45 seg y una extensión a
72°C durante 45 seg con una extensión final a 72ºC durante 10 min. Después será
visualizado en un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio y
conservado a menos 20°C para utilizarlo en posteriores trabajos.
Amplificación del
gen de la integrasa clase I por PCR.
Los oligonucleotidos del gene
de la integrasa clase I utilizados para este trabajo fueron los siguientes:
5'GGCATCCAAGCAGCAAG3 y 3' AAGCAGACTTGACCTGA5.
La reacción de PCR se realizó de la siguiente manera: buffer MgCl2
1X, 100 ng de cada uno de los oligonucleotidos, 0,5 µL DNATaq polimerasa (Promega),
1 µL de dNTPs y 50 µL H2O. 1 µL DNA de salmonella (12,13).
La amplificación
fue llevada a cabo, iniciado con una desnaturalización de 5 min a 94°C , seguido
de 30 ciclos a 94°C durante 45 seg., alineamiento a 50°C durante 45 seg y una
extensión a 72°C durante 45 seg con una extensión final a 72ºC durante 10 min.
La reacción de PCR fue visualizada en un gel de agarosa al 1 % teñido con
bromuro de etidio.
Resultados y Conclusiones
La resistencia antimicrobiana
fue determinada con un sistema automatizado en microplacas (MicroScan System-D)
y por medio de difusión en agar de acuerdo al procedimiento recomendado por la
Food and Drug Adminstration (FDA). Del total de cepas de S.
enteritidis analizadas con el sistema en microplacas, la resistencia a
diferentes antibióticos fue la siguiente: el 21.4% para la combinación
trimetropin-sulfametaxazol, el 11.4% fue para ceftazidima, el 8% para
penicilina, el 6.6% fue para imipenen y el 5.3% presentaron resistencia a
piperacilina y a la combinación ampicilina-sulfametoxasol. En el análisis por
medio de difusión en agar se observó que el 97% de las cepas presentaron
resistencia a nitrofurantoina y carbenicilina, mientras que el 88% de las cepas
presentó resistencia a gentamicina. Por lo que corresponde, a cefalotina y
amikacina el patrón de resistencia fue del 77% y 74.3% respectivamente (Fig.
1). En todas las cepas se amplificó un fragmento de 500 pb el cual
correspondió al gene que codifica para la subunidad 16S ribosomal (Fig.2)
De todas las cepas analizadas, el 38% amplificaron un fragmento de
aproximadamente 900 pb el cual corresponde al gene de la integrasa I como se
muestra en la figura 2.
Figura 1:
Difusión en agar de acuerdo al procedimiento recomendado por la Food and Drug
Adminstration (FDA).
Figura 2:
Amplificación de la subunidad
16S ribosomal en varias cepas de Salmonella enteritidis. Carril 1: MPM (lon
2); Carriles 2 al 13 subunidad 16S ribosomal.
Figura 3:
Gene de la integrasa clase I.
Carril 1: MPM (lon 2); carriles: 2, 3, y 4 Salmonella enteritidis F4, F8
y F13; Carril 5: control negativo.
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