ANTIMICROBIANOS Y ANTIPARASITARIOS EN MEDICINA VETERINARIA SAN ANDRES LARREA, MANUEL

FARMACOLOGIA Y TERAPEUTICA VETERINARIA  ADAMS H. RICHARD

FARMACOLOGÍA VETERINARIA SUMANO

Resumen

El trabajo estuvo encaminado a la comprobación de la acción antifúngica y antibacteriana de las hojas y la corteza del Protium cubense  y la parte foliar del Eupatorium menthaefolium, dos plantas endémicas de la región Oriental de nuestro país,  que son de amplio uso popular, para ello se obtuvo la tintura y  los extractos secos de las partes estudiadas de cada una  de las plantas empleando las normas cubanas aprobadas para estos fines y se determinó además la composición fitoquímica preliminar de cada una de las formulaciones empleadas.

Se comprobó que ambas plantas tienen una potente acción contra cepas de referencia ATCC de Staphilococcus aureus y Candida albicans. La eficacia de los extractos  de estas plantas fue  evaluada por comparación  con antibióticos modelos actualmente en uso para el sistema de salud.

Abstrac

The work was guided to the confirmation of the action antifungical and antibacterial of the leaves and the bark of the Proteum cubense and the foliate part of the Eupatorium menthaefolium, two endemic plants of the Oriental region of our country, that are of wide popular use, for it was obtained the tinture and the dry extracts of the studied parts of each one of the plants using the cuban norms approved for these ends and it was also determined the preliminary fithoquemical composition of each one of the formulations.

It  was proven that both plants have a potent action against reference stumps ATCC of Staphilococcus aureus and Candida albicans. The effectiveness of the extracts of these plants was evaluated by comparison with model antibiotics in use for the system of health.

Materiales y Métodos

Lo primero que se hizo fue seguir la ruta crítica ruta crítica para la investigación científica de los productos naturales. 

Luego se realizó la selección, identificación y recolección del Eupatorium menthaefolium (Rompezaraguey) y el Protium cubense (Copal Verdadero).

Las plantas utilizadas fueron identificadas en  el laboratorio de botánica de la Universidad de Granma siguiendo la descripción que se hace en el libro titulado Plantas Medicinales, Aromáticas y Venenosas de Cuba de  Juan Tomás Roig  y en la Flora de Cuba, los extractos y formulaciones así como el estudio fitoquímico de los mismos se realizó en el Laboratorio de Productos Naturales de la UDG.

El Eupatorium menthaefolium  se recolectó  en las zonas húmedas cercanas a la Sierra Maestra del municipio Bartolomé Masó. Fueron utilizadas las hojas de la planta.

Hora: 10: 00 AM -11: 00AM

El Protium cubense se recolectó en Buey Arriba  en la Zona de Angostura y fueron empleadas la corteza y las hojas de la misma.

Hora: 10: 00 AM -11: 00AM

El Protium cubense en los meses de marzo a mayo, en el momento en que la planta estaba en el estado vegetativo óptimo, el Eupatorium menthaefolium en los meses de Diciembre, Enero y Febrero en iguales condiciones. Además se sometieron al secado al aire libre por 5 días y luego al secado en estufa por 1 hora.

Las formulaciones  farmacéuticas se obtuvieron empleando la NR 312  y el  Control de Calidad fue hecho según NRSP 313

 El PH se  determinó según se establece en  la NC 90-13-13.

Tamizaje fotoquímico:

Este fue realizado según la metodología para este proceso reportada por (Payo, Sandoval y Peña, 2002) en   la monografía “Productos Naturales y su Empleo en la Medicina”

Para desarrollar el tamizaje fitoquímico se informan en la literatura variados esquemas de trabajo que comprenden a su vez el uso de diferentes solventes de extracción.

Es importante señalar que los resultados obtenidos mediante estas técnicas ofrecen solo una visión de la composición química de la planta a estudiar y que no puede tomarse en ninguna caso como un resultado concluyente ya que en la presencia o ausencia de un metabolito pueden  influir de forma determinante:

• La época de recolección.

• El estado vegetativo de la planta.

• Las variaciones ocurridas por una deficiente recolección, secado y/o conservación.

• La concentración de los metabolitos.

• La solubilidad en el solvente empleado.

• Las interferencias de otros metabolitos.

Ensayos biológicos:

La evaluación de la acción antibacteriana y antifúngica se realizó según el protocolo de ensayos in vitro descrito por  (Informe 32 OMS  y Gavan, T, 1982).

Se utilizaron cepas de referencia ATCC de Pseudomona aeruginosa,  Escherichia coli, Staphilococcus aureus   y  Candida albicans.

Lectura e interpretación.

La lectura se puede realizar  a partir de las 16 h de aplicado el disco hasta las 48 h.

La zona de inhibición es el área que rodea al disco donde el crecimiento ha sido completamente inhibido, sin embargo con las cepas de referencia, la zona puede aparecer invadida aunque se define claramente.

No se debe tener en cuenta esta invasión.

Existe un sistema de lectura directa, muy fácil de reproducir, que funde la lectura e interpretación  en un solo paso: Se confeccionan laminas circulares transparente con círculos concéntricos cuyos diámetros delimitan zonas que se corresponden con las categorías “ Sensible”, “Intermedio” y  “Resistente” que aparecen en la tabla de interpretación de Bauer- Kirby.

Basta con hacer coincidir el disco cuyo halo de inhibición se desee leer con él círculo central de lámina de lectura.

El límite de la zona de inhibición, caerá en una de las tres zonas concéntricas. El halo de inhibición se midió con una Regla VD y se expresó en mm. (Ericson, A.M; Sdigmon, S. J, 1971)

Concentración de los extractos empleados.

Para los ensayos in vitro se emplearon tres niveles de concentración bien diferenciados, del extracto de la planta: extracto puro al 100%, 50% y 1%.

Tratamiento estadístico.

El tratamiento estadístico se realizó empleando el paquete Statistic para Windows, versión 6.0, se empleó  el análisis de varianza paramétrico clásico del halo de inhibición  respecto a 3 grupos con 3 niveles de concentraciones y un grupo  control positivo representado por el halo de inhibición de 3 antibiótico modelo.  Este análisis se complemento con un test de newman-keuls, (Stell y Torre, 1992) para la comparación múltiple de medias y fue complementado con un test de Scheffee (J, Sieguel, 1987).

Materiales

Para el montaje del experimento se utilizaron los siguientes materiales:

• Incubadora bacteriológica a 37° C

• Nevera de 2 a 8 ° C

• Hisopo

• Regla VD: 1 mm

• Solución patrón de turbiedad Mc Farland

• Agar de Muller-Hinton

• Caldo de cultivo Muller-Hinton

• Tubos

• Mechero

• Placa  petri

• pinzas

Resultados y Discusión

La selección de estas dos plantas se realizó atendiendo al amplio uso popular, a la disponibilidad de las mismas y su carácter endémico de Cuba y de la Región Oriental.

Se seleccionaron cepas de microorganismos de referencias ATCC para lograr resultados fiables y comparables con los obtenidos en otros estudios y reportados en la literatura.

Se tuvo en cuenta además que estas cepas son las más comunes que se presentan en las enfermedades causadas a enfermos animales y humanos.

Tabla # 2. Resultados del control de calidad de la tintura al 20% de Eupatorium menthaefolium (Rompezaraguey) y el Protium cubense (Copal Verdadero)

Como se observa en la tabla # 2 la tintura al 20% tanto de la corteza y las hojas del  Protium cubense, así como las hojas del Eupatorium menthaefolium   están en los rangos de calidad que establecen las normas para el uso de las formulaciones, ambas tienen un valor de los sólidos totales superior a 3.5 lo que indica una concentración adecuada de principios activos.

La densidad de ambas está por encima de 0,90 g/ml y el pH se estabilizó por debajo de 7 lo que indica que son soluciones ligeramente ácidas hecho este que unido al medio alcohólico en que se preparan permite su estabilización y conservación por períodos de tiempos largos.

Esto fue corroborado  por el análisis de calidad de las muestras testigos, después de un período de seis meses de reposo sin observarse además la formación de sólidos. Se comprobó que los parámetros  de calidad mostrados en la tabla # 2 mantienen sus valores constantes indicando, que la composición y la calidad de las mismas no varían durante este período, lo que se considera como garantía de calidad para las condiciones del experimento.

Composición fitoquímica de los extractos.

La composición de los extractos empleados se realizó según la técnica reportada por (Payo, Sandoval y Peña, 2002) cuyos resultados se muestran a continuación.

Tabla # 3. Resultados del análisis fitoquímico de la tintura al 20% y los extractos secos.

Como se observa en  la tabla # 3 tanto la  corteza como las hojas del Protium cubense son muy ricas en metabolitos, destacándose en las hojas un alto contenido  de flavonoides, antocianidinas, quinonas y cumarinas y en la corteza  cumarinas, azucares reductores, flavonoides y quinonas.

Es importante señalar que el estudio fitoquímico se realizó a la tintura y el extracto seco de ambas partes de la planta demostrándose que la composición de estos se mantiene semejante a la tintura lo cual garantiza que una vez retirado el solvente a la formulación, empleando métodos a baja temperatura como es la roto evaporación no descompone los metabolitos y por tanto las propiedades farmacológicas se deben mantener de forma inalteradas, esto garantiza que los extractos secos y las formulaciones que se preparen a partir de estos tienen la misma composición, es conocida la dependencia que existe entre composición  química y propiedades biológicas.

Debe señalarse que tanto en la corteza como en las hojas de la planta no se detectó la presencia de alcaloide a pesar de que las muestras se trabajaron en condiciones de temperaturas que no  excedió los 45 ºC, por lo que se puede afirmar la ausencia de este tipo de metabolito en las muestras.

Para el caso del Eupatorium menthaefolium se procedió de manera semejante al algoritmo seguido al trabajar el Protium cubense, destacándose  una importante  composición de metabolitos como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4 Composición fitoquímica  del Eupatorium menthaefolium.

Debe destacarse que en este estudio de la composición de las hojas de Eupatorium los metabolitos más importantes detectados son cumarinas, azúcares reductores,  alcaloides y flavonoides.

Experimentos in vitro

Las formulaciones obtenidas y validadas se sometieron a experimentación para comprobar la eficacia frente a bacterias y hongos de referencias con el  empleo de modelos experimentales validados.

Debe destacarse que en los experimentos realizados se utilizaron los extractos secos obtenidos a partir de la tintura para evitar los efectos de enmascaramiento que pueden producir los solventes y de esta forma poder determinar el efecto verdadero de los extractos sobre las bacterias y hongos estudiados.

Se emplearon tres niveles de concentración de los extractos para cada microorganismo y se empleó el protocolo de ensayos descrito para el desarrollo de antibiogramas del MINSAP (58), para medir el efecto antibacteriano y antifúngico se tomaron los halos de inhibición,   se empleó además como referencias el valor de este parámetro para varios antibióticos.

Los resultados obtenidos se presentan a continuación.

Grafico 1 Halos de inhibición del Protium cubense (hojas) frente a 4 microorganismos de referencia.

El  Gráfico 1 muestra la comparación del halo de Inhibición que producen los extractos del Protium cubense contra las tres cepas de bacterias empleadas y contra la Candida albicans.

Donde  se representan valores importantes del halo de inhibición de los extractos  (14 y 12mm) frente a  Staphilococcus aureus  a concentraciones del  100% y 50 % que según la escala de Bauer-Kirby vigente para el MINSAP se clasifica como sensible. Sin embargo para el resto de los microorganismos se obtienen halos de inhibición semejantes.

Debido a los valores de los halos de inhibición de los extractos del Protium cubense  frente a Staphilococcus aureus se realizó una comparación con los valores obtenidos para este parámetro que producen varios antibióticos de uso corriente en el tratamiento de enfermedades bacterianas.

Se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos de las hojas del Protium cubense a concentraciones de 100 y 50%, como se muestra en  el Gráfico 2.

Gráfico  2 Comparación de los halos de inhibición de diferentes antibióticos y del Protium cubense (hojas) a diferentes concentraciones frente al Staphilococcus aureus.

A una concentración del 100% los extractos no mostraron diferencias significativas, mientras que al  50% el extracto del PCH mostró un efecto antibacteriano significativamente superior a la vancomicina y un comportamiento similar a la estreptomicina.  Sin embargo a una concentración del 1% los tres antibióticos ensayados se comportan de una manera similar al compararlos con los extractos del Protium cubense

Gráfico 3 Halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra 4 microorganismos de referencia

En el  Gráfico 3 se representa la comparación  de los halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra los cuatro microorganismos.

Al someter estos resultados a un análisis de varianza este obtuvo para un p<0.01,  diferencias significativas entre los halos de inhibición de esta y el resto de los microorganismos empleados, así como para todas las concentraciones utilizadas.

Este resultado demuestra la potente acción antibacteriana de las formulaciones obtenidas a partir de la corteza de esta planta.

Al comparar este resultado con los halos de inhibición que producen varios antibióticos a diferentes concentraciones se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos del Protium cubense  a concentraciones de 100 y 50%, mientras que a la concentración del 1% existe una diferencia significativamente superior de los extractos del Protium cubense  con relación a los demás antibióticos   como se muestra en el Gráfico 4.

Gráfico 4 Comparación de los Halos de inhibición de diferentes  Antibióticos y  del Protium cubense (Corteza) frente al Staphilococcus aureus

A una concentración de 100% y el 50 % los extractos  mostraron diferencias significativas con respecto a la tatraciclina  a la estreptomicina y la vancomicina, siendo superior su acción frente esta bacteria, mientras que  a una concentración del 1% los extractos del PC se comportan de manera superior en comparación con   los tres antibióticos ensayados.

Gráfico 5 Halos de inhibición del Eupatorium menthaefolium (Hojas) contra  4 microorganismos de referencia

El Gráfico 5 muestra la comparación del efecto de los extractos del Eupatorium menthaefolium contra las tres cepas de bacterias empleadas y contra la Candida albicans, el análisis de varianza arrojó para un p<0.05,  diferencias significativas entre los halos de inhibición de  estas y el resto de los microorganismos excepto frente a la Candida albicans donde se aprecia un comportamiento similar al  Staphilococcus aureus empleado, así como para casi todas concentraciones utilizadas.

Debe destacarse como un aspecto de gran importancia que para el Staphilococcus aureus a concentraciones de 50% y 100 %   del extracto se obtuvo un halo de inhibición considerable con un valor de 18 mm y al 1%  un valor de 11mm.

Otro aspecto de suma importancia es el hecho de que este extracto ha mostrado un espectro de acción frente a la Candida albicans dado por el importante valor del halo de inhibición para el 50% y 100 % de concentración, a pesar de  que mostró acción al 1%.

Gráfico 6 Comparación de los halos de inhibición de diferentes  Antibióticos y  del Eupatorium menthaefolium (Hojas) frente al Staphilococcus aureus

En el Gráfico 6 se muestra la comparación del efecto de los extractos del Eupatorium menthaefolium  y tres antibióticos, tetraciclina, estreptomicina y la vancomicina, frente a Staphilococcus aureus,  basado en la medición de los halos de inhibición. Se pudo demostrar para un p<0.01que  no existe diferencia significativa entre los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos del EM al 100% de concentración, mientras que al  50% y al 1%   los extractos del EM muestran  diferencia significativa superior con relación a los demás antibióticos.

Debe  destacarse que a valores  de concentración del extracto del 1% el halo de inhibición frente al Staphilococcus aureus es elevado con un valor de 11mm, hecho que demuestra la potente acción de los extractos de la planta.

Este trabajo ha tenido entre sus finalidades no solo demostrar la acción antibacteriana y antifúngicas de extractos de diferentes plantas sino encontrar entre los nuevos productos ensayados, cual es el de mejor perfil de acción contra cada microorganismo, para lo cual se ha realizado la comparación de cada uno de ellos en cada una de las concentraciones ensayadas experimentalmente y con el empleo de varios antibióticos como control.

Conclusiones

Luego de concluido el trabajo experimental y atendiendo a los resultados obtenidos se ha llegado a las siguientes conclusiones.

Se obtuvo la tintura y los extractos secos de la corteza y las hojas del Protium cubense, determinando las especificaciones de calidad de la tintura, se determinó la composición fitoquímica preliminar de cada una de las partes estudiadas y se comprobó que en las hojas predominan antocianidinas, cumarinas, flavonoides y quinonas y en  la corteza la contienen además de los tres últimos, azúcares reductores.

Se obtuvo la tintura y los extractos secos de las hojas del Eupatorium menthaefolium, determinando las especificaciones de calidad de la tintura, se determinó la composición fitoquímica preliminar y se comprobó que predominan cumarinas, alcaloides, flavonoides y azúcares reductores.

Se demostró que la composición de la tintura al 20% tanto del Protium cubense como del Eupatorium menthaefolium son semejantes a la composición de los extractos secos.

Se demostró que los extractos del Protium cubense y Eupatorium menthaefolium  tienen una potente acción antibacteriana contra  Staphilococcus  aureus. Mientras que se mostraron inactivos frente a Pseudomona aeruginosa y  Escherichia coli.

Se demostró además que el extracto del Eupatorium menthaefolium  tienen una potente acción antifúngica contra  la Candida albicans.

Recomendaciones

• Emplear formulaciones de corteza y hojas del Protium cubense y hojas del Eupatorium menthaefolium  contra enfermedades producidas por Staphilococcus aureus  y  C. albicans.

• Realizar estudios de toxicidad aguda a los extractos de las plantas estudiadas.

• Ampliar los estudios in vitro  a otros microorganismos.

• Realizar estudios in vivo para corroborar las observaciones realizadas in vitro. 

Literatura

• Antibiotics in la Laboratory Medicine. Victor Lorian M. D, Editor Willians& welkins Baltimore-London.: Second Edition. Los Angeles Sydney, 1986. P 27-60

• Carballo, A. Plantas medicinales del Escambray cubano. Apuntes científicos. TRAMIL VII. Isla San Andrés. Colombia. Enda-caribe. 1995

• Colectivo de autores. Plantas medicinales (Fitomed II). Editorial Ciencias Médicas. La Habana. 1993

• Colectivo de autores. Plantas medicinales (Fitomed III). Editorial Ciencias Médicas. La Habana. 1995

• Ericson, A. M; Sherris, J. D. Acta Patkol. Microbiol. Scond. Suppl 217 (b), 1971

• Gavan, T. Prueba in vitro de susceptibilidad antimicrobiana  “Clin. Med. Nort. AMER, 1974. P 493-504

• Informe 32 OMS Comité de Expertos de la OMS en patrones biológicos: Serie de informes técnicos,# 673.Ginebra-P153-190. 1982

• J. Siegel Sydney   Diseño Experimental no paramétrico. Edición Revolucionaria, 1987. P 188, 240.

• Lioger, H. Plantas medicinales de Cuba y del Caribe. San Juan. Ibero América de Ediciones,  1990. P-500.

• Norma ramal 311 del MINAGRI. La Habana. 1998.

• Norma Cubana 312. Extractos fluidos y tinturas.  Procesos tecnológicos. Salud Pública. La Habana.1998.

• Norma Cubana 313. Extractos fluidos y tinturas. Métodos de ensayos.       Salud Pública. 1998.

• Payo A; Oquendo M; Oviedo R.  Tamizaje Fitoquímico preliminar de plantas que crecen en Sierra de Nipe, Holguín. 30( 2): 120-31. 1996

• Peña, R. A. Algunas consideraciones sobre el empleo de productos naturales en la medicina natural y tradicional. Monografía. Bayamo. 2002.

• Programa Nacional de plantas medicinales. Septiembre. 1999.

• Protocolo para la realización de Antibiogramas MINSAP. La Habana 2005 

• Robineau, L. Hacia una Farmacopea Caribeña. Sto. Domingo, enda-caribe/ UNAH, 1995. P-278.

• Roig, J. T. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. La Habana. Ed. Científico técnico, 1988. P-1125.

• Sandoval, López D; Oquendo Suárez.  Estudio Fitoquímico preliminar de detección de alcaloides y saponinas en plantas que crecen en Cuba. 24 (2): 288-96. 1990

•  Sdigmon, S. J. Post Grad Med.J.40 (Suppl). 1964

• Stell R.G. D. y J. H. Torre.  Biostatistics Principles and procedures. 2ed. Mc Grawhill, Interamericana de México, S.A. Mellrog SG, Thompson. 1992 .

Fuente: VET-UY - Material remitido por  Dr. MVZ. Yanelis Morales Sánchez - Profesora de Zoohogiene Tropical - Departamento de Sanidad Animal - Facultad de Medicina Veterinaria - Universidad de Granma. Cuba