001. 14/04/2004 - Obtención de muestras para laboratorios de bacteriología.

Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado

Grupo de Sanidad Animal

Estación Experimental Agropecuaria Balcarce

INTA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria 

Es importante que cualquier muestra esté acompañada de una historia del caso, con datos clínicos, anatomopatológicos, epidemiológicos (número de animales expuestos, número de afectados en el establecimiento y en el lote donde se presentó el caso), indicar tratamientos y vacunaciones efectuadas, otras enfermedades que se hayan observado en los días precedentes, duración del brote y el diagnóstico presuntivo.

Cabe enfatizar que en cualquier situación, la mejor muestra proviene de la necropsia de un animal enfermo sacrificado. Se debe recordar que ya en el estado agónico ocurre invasión de bacterias intestinales las que se difunden en los tejidos y por ende el diagnóstico bacteriológico se puede complicar, ya que algunos de dichos organismos son patógenos potenciales.

Envases e instrumental

Las muestras deben ser colocadas en envases estériles y con buen cierre. Esto se puede lograr con recipientes de vidrio de boca ancha, limpios y enjuagados con agua destilada, secados en estufa y estériles. El esterilizado se puede lograr en autoclave a 121°C durante 20 minutos o de lo contrario en horno seco 160°C a 180°C durante 2 horas. Los envases de uso culinario, frascos de dulce, mayonesa, etc. provistos de tapa a rosca pueden adaptarse perfectamente como así también la olla de presión que eventualmente reemplazaría el autoclave. 

El material de vidrio envuelto en papel y esterilizado en el horno de cocina, estará estéril cuando el papel adquiere color caramelo. Este material de vidrio una vez estéril debe guardarse en cajas conservando sus propiedades por largo tiempo. Existen en el comercio recipientes colectores de plástico descartable estériles, prácticos y accesibles.

El instrumental (pinzas, tijeras y bisturí) que se utiliza para la extracción de muestras debe estar limpio, seco y bien afilado. Previo a su uso, se sumergen en un recipiente con alcohol y se flamean, logrando así asegurar la asepsia. Se deben descartar los desinfectantes químicos (Espadol, lugol, etc.). En los muestreos realizados a campo, se buscará mantener las mejores condiciones de asepsia.

Muestreo - Extracción y Remisión

1. Líquidos o contenidos de cavidades se colectan con jeringas y agujas estériles, siendo preferentemente trasvasados a tubos o frascos con tapa a rosca.

2. Las secreciones deben extraerse con hisopos de algodón estéril que se sumergirán posteriormente en medios de transporte o en solución fisiológica esterilizada otorgándole así las condiciones necesarias para mantener viables a los gérmenes.

3. Organos: las muestras, de tamaño aproximado de 5 x 5 cm, se extraerán al abrigo de la llama y cuidando de mantener las mejores condiciones ambientales de asepsia. Se examinarán externamente los órganos y se extraerán trozos donde se localicen las lesiones y se incluirán trozos de aspecto normal. El intestino se envasará por separado y con sus extremos ligados manteniendo su contenido intacto. Las muestras de cerebro deben enviarse una parte refrigerada y otra congelada. Los órganos de elección son en general, bazo, pulmón, hígado, riñón y hueso largo previamente descarnado. Cuando exista contaminación se deberá flamear el órgano superficialmente o bien calentar una espátula y apoyarla sobre la superficie a cortar.

4. Conservación y envío del material: los recipientes con su correcta etiqueta identificatoria se colocan en heladera de "telgopor" acondicionados con aserrín o papel y con un número adecuado de refrigerantes. Los trozos de hielo, mezclas refrigerantes o hielo seco colocados en cajas de telgopor, conservan más tiempo el frío si se agrega abundante aserrín de madera o papel, a la vez que protege el o los envases de vidrio. En el caso de tener que enviar las muestras a distancias largas y requerir un período de conservación prolongado, se recomienda sumergir los trozos de órganos en glicerina buferada (pH 7) al 30 % o al 50 % estéril e igualmente enviarlos refrigerados.

5. Sueros: El material a utilizar para la extracción y envío de la muestra (tubos, jeringas, etc.) debe estar seco y limpio. Los restos de humedad y partículas de suciedad provocan hemólisis, no pudiéndose procesar el material remitido. Rotular siempre con claridad los tubos, escribiendo las etiquetas con birome o marcador indeleble y no con lápiz. Las muestras de sangre se extraerán sin anticoagulantes en tubos de 10 a 15 cc, por punción venosa, yugular o coccígea de animales identificados. Estas muestras de sangre entera se pueden conservar refrigeradas 14 a 48 horas. No deben congelarse pues se hemolizan. Una vez producido el coágulo, se separa el suero ya sea por pipeteado o centrifugado, se coloca en tubos de vidrio secos y con tapón. Se pueden conservar congelados por tiempo prolongado (meses). Nunca enviar muestras de sangre por transportes públicos sin que se le haya extraído previamente el suero, pues las mismas arriban siempre hemolizadas y sin valor para análisis serológicos.

No enviar muestras los fines de semana o vísperas de feriados. Siempre contactar telefónicamente con el laboratorio para confirmar el envío.

Tener especial cuidado en el acondicionamiento de muestras por el riesgo de manipular material infeccioso por parte de terceros (carbunclo, fetos, etc.).

Enfermedades que requieren consideraciones especiales

Carbunclo bacteridiano

Remitir las siguientes muestras para su confirmación diagnóstica:

a) Hisopos embebidos en sangre exudada o extracción con aguja y jeringa de la vena yugular de un animal recientemente muerto y fresco.

b) Hueso largo, sin piel, tendones ni músculos envuelto en papel y colocados dentro de una segura envoltura de polietileno.

c) Varios frotis de sangre secados al aire y envueltos en papel.

No realizar la necropsia de los animales muertos con sospecha de carbunclo bacteridiano. Si ésta se hubiera realizado, se extraerán trozos de bazo. En el caso de equinos extraer linfonódulos hemorrágicos e hisopados de exudados. En cerdos, obtener muestras de linfonódulos retrofaríngeos y edema.

Es importante evitar la depredación de los cadáveres incinerándolos lo más rápido posible. Bacillus anthracis esporula en presencia de oxígeno, por lo tanto la apertura de un cadáver permite la formación de esporos que sobreviven en el medio ambiente durante muchos años.

Al descomponerse el cadáver sin apertura del mismo, los procesos de autólisis destruyen muy fácilmente las formas vegetativas del microorganismo.

Si hubiera existido contacto directo entre el operador y el material sospechoso de infección consultar inmediatamente al laboratorio de Microbiología, o bien directamente a un médico, porque puede ser necesaria la inmediata instauración de un tratamiento antibacteriano específico.

Paratuberculosis o Enfermedad de Johne

Se remitirá la válvula ileocecal o varios trozos de intestino de 5 cm, libres de contenido y que presenten lesión macroscópica. Deberán incluirse también muestras de linfonódulos: mesentéricos y de la región ileocecal; en caso de realizar biopsia rectal deberán remitirse por lo menos dos muestras de la porción más anterior posible. Material fecal (50 gs). Se conserva refrigerado o congelado. Pueden enviarse improntas realizadas a partir de biopsias de recto, secadas al aire y envueltas en papel.

Sueros: se recomienda sangrar bovinos mayores de 3 años y evitar la cercanía con el parto.

Aborto Infeccioso

Fetos y membranas (se dan detalles en la sección correspondiente en profundidad). 

Examen de la placenta: eliminar la suciedad, lavar con agua corriente y colocar en una bandeja para examinar los cotiledones y la membrana en su totalidad buscando la presencia de focos necróticos. Se puede enviar una porción de placenta intacta para bacteriología.

Preparar frotis de éstos y de tejidos normales para ulteriores coloraciones (Gram, Machiavello, Ziehl Neelsen modificado). Se recomienda el envío de muestras para estudios histopatológicos.

Examen del feto: se lava con solución desinfectante (Espadol-lugol). Se examina la superficie externa buscando localizar posibles infecciones micóticas. Una vez abierto se extraerán órganos para examen bacteriológico, incluyéndose cerebro, pulmones, hígado, bazo, riñones, ojo, contenido de estómago, líquidos cavitarios y sangre.

Leptospirosis

Muestras: fetos, órganos de éstos (hígado, pulmón, riñón), líquidos cavitarios: toráxico y abdominal; se considera muy útil el humor acuoso de fetos. La orina de las vacas abortadas se obtiene provocando reflejo de la micción o por previa inyección de diuréticos (furosemida) y recolectando la misma en frascos estériles para su posterior siembra y/o inoculación en animales de laboratorio. Se debe enviar refrigerada lo antes posible, ya que debe procesarse dentro de las 6 horas de extraída.

Sueros: se recomienda el sangrado de vientres abortados y sanos del rodeo problema. Se puede incorporar al estudio el suero del feto. Conservar ambos congelados. Se realizarán en los vientres dos extracciones con 15 ó 20 días de diferencia entre una muestra y la otra para evaluar si hubiera seroconversión de los títulos. Tiene valor diagnóstico en la etapa aguda de la enfermedad mientras que tiene poco valor en la etapa crónica.

Brucelosis

A partir de fetos, obtener líquido de abomaso, trozo de bazo, pulmón, hígado y una porción de placenta. Evitar el congelado. Se debe acompañar de sueros del rodeo problema y de las madres abortadas. Previa identificación de los animales, extraer la muestra de sangre y posteriormente conservar el suero. Muestrear como mínimo el 10 % del rodeo.

Pueden existir animales que sean seronegativos al momento del aborto, por lo que puede ser necesario repetir el muestreo a las 3 semanas. Se puede extraer secreción de los cuartos mamarios y mucus cérvico-vaginal (utilizar un medio de transporte, por ej: Amies) que también es buen material para cultivo en vacas abortadas. En toros se puede recolectar fluído seminal mediante masaje transrectal de las vesículas seminales y ampollas enviando dicho material refrigerado para cultivo o bien para realizar la prueba de BPA o 2ME con el plasma seminal. Cualquier título en dicho plasma seminal es positivo.

Campylobacteriosis bovina

A partir de los fetos: líquido de abomaso, pulmón y bazo. Enviar refrigerado dentro de las cuatro horas de obtenida la muestra. También se puede utilizar medio de transporte Cary -Blair el cual permite la sobrevida del microorganismo por 24-48 hs, desde la extracción hasta su procesamiento en el laboratorio.

Esmegma prepucial: para los casos en que se realice el cultivo se sugiere como condición ideal extraer la muestra con pipeta Cassou y colocarla en medio de transporte Cary-Blair. En caso de estar sucia la muestra, lavar la cavidad prepucial con 20 ml de solución fisiológica bufferada (SFB, pH 7,2) y luego extraer la muestra con pipeta estéril.

Para análisis por inmunofluorescencia directa se puede utilizar raspador o pipeta Cassou, colocando la muestra en SFB formolada al 1%, conservando la muestra refrigerada.

Hembra: extraer mucus cérvico-vaginal con pipeta de IA Cassou (vainas azules descartables) y colocarla en el medio de transporte Cary-Blair, enviando la misma refrigerada.

Diarrea neonatal de los bovinos y porcinos

Enviar materia fecal de animales con síntomas. De los cadáveres extraer: hígado, bazo, trozos de duodeno y yeyuno ligados por los extremos, frotis de mucosa duodenal, otros órganos con lesiones. Remitir refrigerado para análisis tanto bacteriológicos como virológicos.

Neumonías

Enviar trozos de pulmón afectado refrigerados (4-8°C), líquido pleural o pericárdico, linfonódulos mediastínicos. En caso de búsqueda de Haemophilus sp enviar la muestra en medio de transporte AMIES.

Salmonelosis

Enviar materia fecal refrigerada (4-8°C), contenido intestinal, duodeno, yeyuno, hígado con lesiones, bilis, bazo, pulmón, linfonódulos regionales. No congelar.

Tuberculosis bovina

Enviar refrigerado (4-8°C) órganos con lesiones, linfonódulos de la cabeza, tórax y abdomen. Se pueden enviar hisopados nasales tomando bien profundo con hisopo estéril.

Mastitis

Es conveniente realizar la higiene de los cuartos mamarios con un algodón o servilleta de papel descartable embebida en alcohol 70°. Ordeñar con cuidado descartando los primeros chorros de leche y recolectar en un recipiente estéril de boca adecuada. Enviar leche de cada cuarto y conservar refrigerado a 4-8°C.

* No congelar, enviar refrigeradas, no utilizar medios de transporte; en caso de prolongado transporte, enviar en glicerina al 50%. 

** IFD: inmunofluorescencia directa.