002. 24/05/2004 - Obtención de Muestras Para Diagnóstico en Laboratorio de Virología.

Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado

Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado

Grupo de Sanidad Animal 

Estación Experimental Agropecuaria Balcarce

Los síntomas asociados a muchas enfermedades virales son similares entre sí, e indistinguibles de infecciones bacterianas, o intoxicaciones. La simple observación clínica de los animales afectados no es relevante para llegar al diagnóstico final y por lo tanto es necesaria la obtención de muestras clínicas y/o de necropsias para el envío al laboratorio de diagnóstico.

Métodos de diagnóstico

Para arribar a un diagnóstico virológico se requiere la evaluación de parámetros epidemiológicos, clínicos y de laboratorio. La interpretación de los resultados es compleja y requiere el conocimiento de las limitaciones de cada método, como así también entender los mecanismos (patogenia) de cada infección viral. El criterioso análisis de los resultados permitirán una aproximación al diagnóstico final.

El diagnóstico de una enfermedad viral se basa en tres métodos principales: 1) aislamiento y caracterización viral, 2) demostración de virus, antígeno viral, o ácidos nucleicos virales en tejidos, secreciones, o excreciones y 3) detección y cuantificación de anticuerpos específicos.

1. Aislamiento viral

El aislamiento de virus es el método de elección para confirmar la presencia del virus como agente causal de la enfermedad. Es costoso, relativamente complejo y se requieren laboratorios de mediana infraestructura y personal altamente capacitado.

Requerimientos y muestras para aislamiento viral:

El momento de la toma de la muestra: La mejor muestra es siempre aquella proveniente de la etapa inicial de la enfermedad cuando el virus se encuentra en el pico de máxima concentración en los tejidos y fluidos corporales. Esta se puede obtener de un animal enfermo que se sacrifica y necropsia, evitando la contaminación post-mortem. Las muestras deben ser colectadas en forma aséptica en envases con buen cierre.

El tipo de muestra: El tipo de muestra a tomar depende de los síntomas y de la patogenia de la enfermedad que se sospecha. El conocimiento de la enfermedad, epidemiología y lesiones, indicarán al profesional la muestra a extraer (ver Cuadro I). Una vez obtenidas las muestras deberán remitirse al laboratorio apropiadamente identificadas, con la historia del caso incluyendo un diagnóstico presuntivo.

Condiciones de envío de la muestra: Cuando la temperatura ambiente es moderada y el tiempo que transcurre hasta que llega al laboratorio es menor de 24 hs, se pueden enviar refrigeradas (0 – 8°C). Si las temperaturas son elevadas o el tiempo de transporte es mayor de 24 hs se recomienda el envío congelado (hielo seco, -70°C). En caso de virus lábiles (ej. herpesvirus, coronavirus, etc.) se recomienda el envío con medios de transporte. El envío debe acompañarse de un protocolo en el que consten los datos anamnésicos y de necropsia, tendientes a la orientación del diagnóstico. Cada muestra debe ser identificada (nombre del veterinario, muestra, fecha).

Acondicionamiento de las muestras

A.- Refrigeradas (4 °C)

Deben llegar al laboratorio en menos de 24 hs.

Muestras:Tejidos para aislamiento. Sangre para serología.

Materiales necesarios: Refrigerantes, hielo, algodón, bolitas de telgopor, o viruta, o aserrín, cartón, conservadora de telgopor. Tela adhesiva.

Técnica: Tapizar el fondo de la caja con una plancha de algodón. Sobre ésta ubicar las muestras, agregar el material de "Callage" (viruta, telgopor, etc.), luego colocar el elemento refrigerante (hielo o sachets). Colocar otra capa de algodón, tapar y sellar la caja con cinta adhesiva.

B.- Congeladas (-70 °C)

Muestras: Tejidos para aislamiento o suero para serología.

Refrigerante: hielo seco.

Materiales y técnica: Idem anterior

C.- Medios de transporte

En determinados casos (ej. muestras de mucus cérvico-vaginal (MCV) de vacas abortadas) las muestras deben colocarse en el medio de transporte de Hank´s (provisto por este laboratorio).

2. Identificación de virus

Se determina el agente etiológico, demostrando en forma directa virus o componentes del virus en tejidos, secreciones y excreciones de animales afectados. En la rutina de diagnóstico éstos pueden dividirse en:

Detección de antígeno viral

• ELISA

• Inmunofluorescencia

• Inmunoperoxidasa

Detección de ácido nucleico viral

• Reacción de cadena de la polimerasa (PCR)

• Hibridización de ácidos nucleicos: in situ, in vitro, do blot.

El tipo y acondicionamiento de las muestras a obtener y remitir para estas técnicas es similar a lo descrito para el aislamiento viral. Las técnicas de fluorescencia e inmunoenzimáticas (peroxidasa, ABC) tienen como ventaja adicional que permiten procesar tejidos fijados en formol neutro bufferado al 10%.

3. Serología

La clave para la interpretación serológica de las enfermedades virales está en comprender que se trata de un análisis retrospectivo ya que detectan anticuerpos que desarrollaron luego de una infección viral. El diagnóstico se basa en demostrar anticuerpos específicos contra un virus en dos muestras de suero (muestras "pareadas") de un animal obtenidas a determinado intervalo. La primera debería tomarse cuando se detecta la enfermedad (fase sintomática), antes de que se formen anticuerpos, y la segunda debería obtenerse a las 3 semanas posteriores (fase convalesciente). Sólo en una muestra en la que el título de anticuerpos aumenta significativamente entre muestreos (más tres diluciones del suero), la seroconversión tiene valor diagnóstico.

A menudo se remite al laboratorio una sola muestra de suero, dado que es imposible obtener dos muestras de un mismo animal. Estas muestras tienen valor parcial en el diagnóstico.

Las muestras de suero deben remitirse al laboratorio congeladas; si se envía sangre, ésta debe estar a temperatura ambiente o refrigerada, nunca congelada.

Control de la Diarrea Viral Bovina

El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) infecta a bovinos de todas las categorías causando cuadros digestivos, respiratorios y reproductivos (infertilidad, muerte embrionaria, abortos, teratogénesis etc.) de gravedad variable. Además la infección fetal puede originar el nacimiento de terneros persistentemente infectados (PI) con el virus. Si bien la frecuencia de animales PI es baja (1 al 2%), su presencia es epidemiológicamente relevante ya que estos animales (seronegativos y que siempre están eliminando virus) garantizan la permanencia del VDVB en las poblaciones bovinas. Por otra parte, debe tenerse en cuenta que la sobreinfección de bovinos PI con el biotipo citopático del VDVB ocasiona un cuadro diarreico fatal denominado enfermedad de las mucosas.

Para el control de la DVB se recomiendan dos estrategias complementarias: 1) detección y eliminación de los animales PI y, 2) vacunación de las hembras pre-servicio para evitar la infección fetal. Inicialmente debería determinarse si en un rodeo hay animales PI, para posteriormente proceder a su identificación y eliminación. El siguiente esquema de trabajo permite el diagnóstico y control de la DVB a un costo razonable:

Signos de DVB en el rodeo

Clínica 

1. Infertilidad, abortos, fetos momificados.

2. Nacimiento de terneros con alopecia, ciegos, problemas de equilibrio.

3. Cuadro diarreicos leves a severos, enteritis hemorrágica.).

Detección serológica

1. La presencia de animales PI causa una tasa de infección elevada en el rodeo.

2. Método: debe obtenerse una muestra de suero del 10% de la población de bovinos de 6 - 12 meses de edad (no vacunados).

3. Interpretación: un significativo número de bovinos jóvenes con alto título de anticuepos neutralizantes (=1:128) indica la presencia de animales PI.

Detección de bovinos PI

Método I (mayor sensibilidad, más costo)

1. Muestra de sangre con anticoagulante de todos los animales del rodeo.

2. Detección de virus por inmunoperoxidasa en microplacas.

Método II (mayor riesgo sanitario)

1. Serología a todo el rodeo.

2. Muestras de sangre con anticoagulante de los animales seronegativos.

3. Detección de virus por inmunoperoxidasa en microplacas.

4. Puede haber bovinos PI con anticuerpos que no se evalúan.

* Se refiere a una muestra para serología y otra con anticoagulante para aislamiento. Repetir la muestra para serología a las 3 semanas. Adaptado de Fenner et al., 1987